超聲波預(yù)處理協(xié)同酶提取近江牡蠣活性肽研究

藍(lán)尉冰，韓鑫，陳冠余，陳美花1，，4

（1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北部灣海洋生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535099；2.欽州學(xué)院，廣西欽州535099；3.廣西大學(xué)，廣西南寧530004；4.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535099；5.武漢理工大學(xué)，湖北武漢430063）

近江牡蠣，屬軟體幼物門[1]，是廣西沿海地區(qū)特有的名貴海洋貝類品種，主要分布在北海市西部到防城港一帶河口附近低鹽海區(qū)，欽州龍門附近茅尾海出產(chǎn)的牡蠣歷史最為悠久[2]。其以肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量超過40%，被稱為“海中牛奶”，此外，近江牡蠣含有豐富的生物活性肽物質(zhì)，當(dāng)前有現(xiàn)代醫(yī)

學(xué)研究表明活性肽具有很高的醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值，在降低血糖、血壓、抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力等領(lǐng)域都具有特殊的生物活性[3-10]。廣西北部灣沿海天然近江牡蠣資源豐富，主要分布于茅尾海海域附近[11]，因此，充分利用地理優(yōu)勢(shì)，研究近江牡蠣活性肽提取工藝，對(duì)其藥用開發(fā)與利用具有重要意義。超聲提取作為一種新型的輔助提取手段，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品等許多科學(xué)研究領(lǐng)域。超聲空化效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞壁的破壞，增強(qiáng)溶劑和目標(biāo)化合物之間的接觸[12]，超聲波細(xì)胞破碎的原理主要是由電能轉(zhuǎn)化得到的聲能通過液體介質(zhì)而變成一系列小氣泡，氣泡炸裂隨之引起破碎細(xì)胞的作用[13]。且破壞完整的空間結(jié)構(gòu)，部分弱鍵斷裂，內(nèi)部非極性基團(tuán)暴露到分子表面，增大酶接觸位點(diǎn)，使提取過程更高效，更環(huán)保[14]。酶解法破壞細(xì)胞壁的特殊化學(xué)鍵，達(dá)到破壁效果，其具有高度專一性，條件溫和，一般不會(huì)破壞原料物化性質(zhì)。歐成坤等[15]認(rèn)為隨著水解程度的增大，大分子的蛋白質(zhì)不斷被水解成小分子肽類，與此同時(shí)水解產(chǎn)物對(duì)蛋白酶活性的抑制作用也減弱，由此可知，可通過測(cè)定酶解液氨基態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量間接表征活性肽含量[16]。本試驗(yàn)期望通過超聲波預(yù)處理輔助酶酶解，考察料水比、超聲功率、加酶量、pH值、酶解時(shí)間對(duì)近江牡蠣活性肽提取率的影響，以氨基態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量為指標(biāo)反映活性肽含量，即氨基態(tài)氮含量越大，近江牡蠣的水解程度越大，酶解液中活性肽的含量越大。利用正交試驗(yàn)法對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，以提高近江牡蠣活性肽提取率，為不同海域牡蠣活性肽含量對(duì)比及其結(jié)構(gòu)分析提供理論數(shù)據(jù)指導(dǎo)，并為近江牡蠣高值產(chǎn)品加工多樣化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣：欽州市鴻發(fā)市場(chǎng)；堿性蛋白酶（5.0×104U/g）、胰蛋白酶（5.0×104U/g）、酸性蛋白酶（5.0×104U/g）、中性蛋白酶（5.0×104U/g）：無錫酶制劑廠；菠蘿蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；DKrS28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Phs-2型酸度計(jì)：上海第二分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶種的選擇

將新鮮的近江牡蠣肉清洗后用組織搗碎機(jī)搗碎，取10 g肉漿，按表1進(jìn)行試驗(yàn)，后加熱100℃滅酶活15 min，后將酶解液以4 000 r/min離心15 min，取其上清液到50 mL的容量瓶定容，待用[17-19]。

表1 酶種及其條件Table 1 Enzyme species and conditions

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以氨基態(tài)氮為指標(biāo)，考察料水比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL），超聲功率（100、200、300、400、450、500 W）；加酶量（400、800、1 200、1 400、1 600 U/g），pH 值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），水解溫度（40、45、50、55、60 ℃），水解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）7 個(gè)因素對(duì)其影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20]，選取對(duì)近江牡蠣活性肽提取有較大影響的超聲波功率、pH值、料水比、加酶量、酶解時(shí)間5個(gè)因素，設(shè)計(jì)五因素四水平正交試驗(yàn)，以優(yōu)化提取工藝。因素與水平見表2。

表2 因素水平表Table 2 actor level table

1.2.4 氨基態(tài)氮（AAN）含量測(cè)定

氨基態(tài)氮（AAN）含量測(cè)定采用電位滴定法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的確定

為選出合適酶種，分別選取堿性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶，并在其最佳作用條件下進(jìn)行酶解，所得結(jié)果如圖1所示。

圖1 5種外源性蛋白酶對(duì)近江牡蠣酶解效果圖Fig.1 Effect of five exogenous proteases on enzymatic hydrolysis of Ostrea rivularis Gould

5種蛋白酶對(duì)近江牡蠣的酶解效果不一致。其中，堿性蛋白酶水解效果最大，為8.44 mg/g，中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶相差不大，分別為5.50、5.71、6.20 mg/g，酸性蛋白酶酶解效果最差，為4.48 mg/g，約為堿性蛋白酶1/2。不同種類酶水解效果不一致可能是不同的酶對(duì)牡蠣蛋白肽鏈的作用位點(diǎn)不同，在不同的環(huán)境下酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用效果有所區(qū)別。此結(jié)果與付勁[21]效果趨勢(shì)基本是一致的。由此可選堿性蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

2.2 料水比對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響

料水比對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖2。

圖2 料水比對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響Fig.2 Effect of solid-water ratio on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由圖2可知，料水比是影響酶對(duì)近江牡蠣活性肽的酶解效果的因素之一。隨著水分濃度的增大。溶液中活性肽含量逐漸增多，但加入過多的蒸餾水，堿性蛋白酶被稀釋，酶解效果降低，漿液本身總活性肽含量下降，造成資料浪費(fèi)，超聲破碎利用不充分。加入的蒸餾水太少，近江牡蠣液濃度過高時(shí)超聲波空化作用難形成[22]，不利于蛋白質(zhì)釋放，影響到酶與底物的接觸面積，從而使酶解的效果降低。故宜選取料水比為1∶4（g/mL）。

2.3 超聲功率對(duì)近江牡蠣活性肽提取的影響

超聲波功率對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲波功率對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖3可知，超聲波功率對(duì)提取活性肽有顯著影響。在100 W～450 W，氨基態(tài)氮含量隨超聲波功率增大而增大，在450 W達(dá)到最大值為15.51 mg/g，后降低。其原因可能是空化效果隨超聲波功率變大增強(qiáng)，超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用也隨之增強(qiáng)[23]，活性肽釋放率逐漸增大，表征出來的氨基態(tài)氮含量也逐漸增大。但隨著功率達(dá)到450 W后，活性肽溶出速率未見顯著提升。與江凌等[24]的研究結(jié)果基本一致，試驗(yàn)宜選450 W超聲波功率。

2.4 加酶量對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響

加酶量對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖4。

圖4 加酶量對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖4可知，當(dāng)加入酶的量越多，氨基態(tài)氮的含量就越多，當(dāng)加酶量達(dá)到1 400 U/g時(shí)，含量最高，加入的量大于1 400 U/g，含量相對(duì)降低，說明在加酶量為1 400 U/g時(shí)，酶與底物的結(jié)合達(dá)到了飽和的狀態(tài)。故水解近江牡蠣的宜選加酶量為1 400 U/g。

2.5 pH值對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響

pH值對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響Fig.5 Effect of pH on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由圖5可知，隨著pH值的增加，氨基態(tài)氮的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)閜H值是使酶變性的一個(gè)重要原因，而蛋白酶在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的環(huán)境下，酶因相互減弱，對(duì)相同電符的基團(tuán)互相排斥而表現(xiàn)不穩(wěn)定，酶分子上的催化基團(tuán)、結(jié)合基團(tuán)和其它基團(tuán)的電離作用發(fā)生了改變，最終使酶變性失活。堿性蛋白酶對(duì)近江牡蠣水解的適宜pH值為8.5。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響

酶解時(shí)間對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)近江牡蠣活性肽提取影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖6可知，隨著酶解時(shí)間的延長，氨基態(tài)氮的含量明顯增大，當(dāng)酶解時(shí)間在3 h以上時(shí)，氨基態(tài)氮含量基本保持不變，主要因?yàn)樵诩用噶坎蛔兊那闆r下，隨著酶解時(shí)間的延長，酶和底物的反應(yīng)越充足，最后使蛋白酶達(dá)到飽和的狀態(tài)而不能使反應(yīng)持續(xù)地進(jìn)行，從而使得酶解產(chǎn)物隨著酶解時(shí)間的延長而保持產(chǎn)量不變的現(xiàn)象。但由于在試驗(yàn)中在合理的情況下選取的時(shí)間越短越好，避免蛋白質(zhì)變性而給實(shí)驗(yàn)帶來的誤差，因此為了合理安排試驗(yàn)所需要的時(shí)間，酶解3 h時(shí)是水解的適宜時(shí)間。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

在王一兵[14]對(duì)近江牡蠣的酶解工藝研究中，超聲波時(shí)間對(duì)酶解的效果影響不大，而據(jù)文獻(xiàn)資料中對(duì)堿性蛋白酶對(duì)牡蠣的最佳酶解工藝研究結(jié)果顯示[17]，溫度屬于次要因素，因此在正交試驗(yàn)中可以不考慮這兩個(gè)因素。故選取超聲波時(shí)間為10 min，溫度為55℃，考察超聲功率、pH值、料水比、加酶量、酶解時(shí)間五因素四水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results on orthogonal test

從表 3 中的試驗(yàn)結(jié)果 RD＞RC＞RE＞RB＞RA可知，各因素的對(duì)活性肽提取影響的主次順序?yàn)椋篋（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解時(shí)間）＞B（pH 值）＞A（超聲波功率）；在此試驗(yàn)中試驗(yàn)指標(biāo)越大越好，所以堿性蛋白酶輔助超聲波后的最優(yōu)水解條件為：A3B1C2D3E2即超聲波功率為 450 W，pH 值 8.0，料水比為 1∶3（g/mL），加酶量為1 400 U/g，酶解時(shí)間3 h。

一般的，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的方差分析中，正交表中沒有安排空列項(xiàng)，即沒有誤差項(xiàng)，則可把對(duì)水解效果影響最小的因素項(xiàng)當(dāng)作誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。因此在本試驗(yàn)中因素A可當(dāng)作誤差項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。方差分析表如表4所示。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

據(jù)表4中的F值可知，因素的主次順序?yàn)镈（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解時(shí)間）＞B（pH 值）＞A（超聲波功率），這與極差分析的結(jié)果是一致的，因此可以確定堿性蛋白酶輔助超聲波后對(duì)牡蠣的酶解的最優(yōu)方案為A3B1C2D3E2即超聲波功率為450 W，pH值為8.0，料水比為 1∶3（g/mL），加酶量為 1 400 U/g，酶解時(shí)間 3 h。

綜上所述，堿性蛋白酶輔助超聲波后對(duì)近江牡蠣活性肽提取的最佳酶解工藝為：超聲波功率450 W，超聲波時(shí)間 10 min，溫度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解時(shí)間3 h。并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此試驗(yàn)中所測(cè)得的氨基態(tài)氮（ANN）含量為26.13 mg/g。比以上的試驗(yàn)中的氨基態(tài)氮的含量都要高，由此驗(yàn)證了此酶解工藝參數(shù)的準(zhǔn)確性。確定了此酶解工藝條件對(duì)近江牡蠣活性肽提取實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的可行性。

3 結(jié)論

采用超聲波預(yù)處理協(xié)同酶技術(shù)從近江牡蠣提取活性肽，以氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考察了料水比、超聲功率、加酶量、pH值、酶解時(shí)間對(duì)近江牡蠣活性肽提取的影響，得到最優(yōu)提取工藝條件為：超聲波功率450 W，超聲波時(shí)間10 min，溫度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解時(shí)間3 h。并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此試驗(yàn)中所測(cè)得的氨基態(tài)氮（ANN）含量為26.13 mg/g。

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