大豆分離蛋白、卡拉膠與肌原纖維蛋白間的相互作用

康偉

（天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300462）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是一種重要的功能性蛋白質(zhì)，在肌肉蛋白質(zhì)中占到55%左右，除賦予肉制品特有的風(fēng)味、口感和營養(yǎng)外，其功能特性，如乳化性和凝膠性等還對產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和感官起重要的作用。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）由于營養(yǎng)豐富、含有人體必需氨基酸、不含膽固醇并且價格低廉等特點(diǎn)在肉制品加工生產(chǎn)中應(yīng)用較多，同時，大豆分離蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有良好的持水性、乳化性、凝膠性等特點(diǎn)，將其添加到肉制品中，可降低蒸煮損失、防止肉汁離析、促進(jìn)水分和脂肪的吸收、改善口感等，可以顯著的改善產(chǎn)品品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的[1-3]。當(dāng)SPI應(yīng)用于肉制品時，由于SPI的變性溫度遠(yuǎn)高于普通肉制品加熱的最高溫度，導(dǎo)致SPI不能與肌原纖維蛋白發(fā)生充分的相互作用[4-5]，因此，研究大豆蛋白和其他食用物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配，從而有效的提高肌原纖維蛋白的功能特性?？ɡz（carrageenan，簡稱CAG）是一種硫酸酯海藻多糖，由于其中硫酸酯基含量和結(jié)構(gòu)的不同，因此卡拉膠具有多種類型。κ-卡拉膠具有極強(qiáng)的形成凝膠的能力，在肉蛋白加熱形成凝膠過程中起到顯著的保水和凝膠增強(qiáng)作用，因此在香腸、午餐肉等熟肉制品中應(yīng)用較廣。本研究將不同添加比例的CAG、SPI和CAG+SPI復(fù)配物添加到肌原纖維蛋白中形成復(fù)合蛋白體系，研究對復(fù)合蛋白乳化特性，復(fù)合凝膠持水性、質(zhì)構(gòu)特性、白度和微觀結(jié)構(gòu)的影響，并討論了CAG、SPI及二者復(fù)配對肌原纖維蛋白乳化和凝膠特性影響的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背部最長?。捍鬂櫚l(fā)超市；大豆分離蛋白（食品級，純度99%）：鄭州市紅展化工產(chǎn)品有限公司；卡拉膠（食品級，純度99%）：湖南維興生物科技有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ-DTF型精密電子天平：常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；TDL-5M冷凍離心機(jī)：常州市儀都儀器有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；雷磁PHBJ-260型便攜式酸度計：上海寶賽生物科技有限公司；T18高速勻漿機(jī)：德國IKA公司；美譜達(dá)UV-1800紫外可見分光光度計：浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；TEX-AN 200型質(zhì)構(gòu)分析儀：法國LAMY公司；NR10QC通用色差計：北京京海正通科技有限公司；KH-7700型掃描電子顯微鏡：日本浩視公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

根據(jù)Xiong等[6]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白的提取。將瘦肉切碎，加入4倍體積10 mmol磷酸鹽、0.1 mol NaCl、2 mmol MgCl2和1 mmol乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）（pH 7.0）配制成的蛋白提取液均質(zhì)60 s。用冷凍離心機(jī)將勻漿液置于4℃條件，離心轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心15 min，之后倒掉上清，進(jìn)行3次重復(fù)。再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液勻漿，3 500 r/min下離心15 min，重復(fù)3次。最后一次將均質(zhì)后溶液，用紗布進(jìn)行過濾，得到的溶液用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為6.0，繼續(xù)進(jìn)行離心，倒掉上清液，收集沉淀。提取需在4℃條件下進(jìn)行，提取后的肌原纖維蛋白置于4℃的冰箱備用。

1.3.2 復(fù)合蛋白體系及凝膠制備

本試驗共分為4組，添加SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白體系及凝膠的制備如表1。

表1 復(fù)合蛋白體系的制備Table 1 Preparation of complex protein system %

肌原纖維蛋白濃度為40 mg/mL，復(fù)合蛋白體系混勻攪拌30 min，進(jìn)行以下乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定，將復(fù)合蛋白體系在80℃水浴加熱30 min制備凝膠，冷卻后置于4℃隔夜保藏，測定以下指標(biāo)。

1.3.3 復(fù)合蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

根據(jù)Pearce等[7]的方法。復(fù)合肌原纖維蛋白溶液的乳化活性（Emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（Emulsifying stability index，ESI），計算公式如下：

式中：A500為500 nm波長處的吸光度；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ =0.2%）；A0、A10為乳狀液在 0、10 min的吸光度；c為初始蛋白質(zhì)溶液中蛋白濃度，g/mL；dilution為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 復(fù)合蛋白凝膠持水性（Water holding capacity，WHC）測定

將凝膠從4℃冷藏中取出于室溫下靜置30 min，之后轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，在4℃條件下，轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心30 min。將離心管倒置20 min后，用吸水紙吸取凝膠析出的水分，進(jìn)行稱重。

WHC/%=離心后凝膠凈重/離心前凝膠凈重×100

1.3.5 復(fù)合蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的測定

將蛋白凝膠取出于室溫靜置30 min，參考王博等[5]的方法并略作修改。將待測樣品平放于測定平臺上，利用物性分析儀進(jìn)行測量。參數(shù)設(shè)定如下：探頭型號選擇P/50，下壓距離50%，觸發(fā)力為5 g，測試前速率為5 mm/s，測試速率為2 mm/s，測試后速率為5 mm/s。每個樣品進(jìn)行6次重復(fù)試驗。

1.3.6 復(fù)合蛋白凝膠白度值（Whiteness，W）的測定

使用色差計測定凝膠的色差，即L*值（亮度值），a*值（紅度值），b*值（黃度值）。試驗過程中每個樣品均進(jìn)行3次平行試驗，試驗結(jié)果取平均值。并根據(jù)Park[8]的方法進(jìn)行白度值計算：

1.3.7 復(fù)合蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考王博等[5]的方法進(jìn)行復(fù)合蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

本試驗用 Statistix 8.1軟件對數(shù)據(jù)作出分析，SigmPlot 12.0軟件進(jìn)行作圖，每組數(shù)據(jù)均做3次獨(dú)立的重復(fù)平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白乳化性能的影響

圖1為添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白的乳化活性（圖1A）和乳化穩(wěn)定性（圖1B）的變化。

當(dāng)添加濃度0時，即純MP對照組。從圖1可看出，添加SPI、CAG和SPI+CAG的混合蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性均顯著高于MP，隨著添加比例的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05），復(fù)合蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性按大小排序均為：SPI+CAG＞CAG＞SPI，且在同一濃度梯度條件下，SPI+CAG復(fù)合蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均顯著高于SPI和CAG復(fù)合蛋白（P＜0.05）。

圖1 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the emulsifying activity and emulsification stability of myofibrillar protein

當(dāng)SPI、CAG和SPI+CAG添加量為最大時，與MP組相比，復(fù)合蛋白的乳化活性分別提高了47%、84%和96%，同時，復(fù)合蛋白的乳化穩(wěn)定性分別提高了92%、149%和166%。SPI作為一種天然乳化劑，乳化性能好，能很好的促進(jìn)油脂吸收或蛋白與油脂結(jié)合，形成穩(wěn)定性較好的乳狀液，同時，經(jīng)加熱后的SPI球蛋白，通過隨機(jī)鏈接會形成一些可溶性聚集束，通過疏水鍵相互作用后會形成蛋白凝膠[5，9]，具有保水保油性、乳化穩(wěn)定性等功能特性，在肉制品中應(yīng)用較多。有研究表明，卡拉膠作為一種陰離子多糖可以與肌原纖維蛋白發(fā)生相互作用，提高蛋白的持水、持油能力，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合蛋白體系。由于多糖和蛋白質(zhì)均具有穩(wěn)定的乳化特性，在乳化過程中蛋白分子通過吸附在油水界面上，從而可形成具有一定粘彈性的保護(hù)膜，因此，推斷多糖和蛋白質(zhì)混合物也會具有良好的乳化特性[9-10]，在本試驗中，在MP中添加SPI和CAG復(fù)配物，二者協(xié)同作用使復(fù)合體系的乳化性能顯著提高。

2.2 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

圖2表示添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠持水性的變化。

從圖2可以看出，與MP組相比，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠持水性均呈上升趨勢，且隨著添加量增加，凝膠的持水性增大，其中添加CAG和SPI+CAG均能顯著提高肌原纖維蛋白凝膠的持水性（P＜0.05），當(dāng)添加量為最大時，CAG和SPI+CAG的凝膠保水性較MP組分別提高了11%和8%，但二者間不存在顯著差異（P＞0.05）。之前研究表明，肉和非肉蛋白的相互作用會影響產(chǎn)品凝膠的特性，對產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)起到一定修飾的作用[11]，SPI的肽鏈骨架上含有很多極性基，因此具有很好的吸水性和保水性，最高可吸收并保持自身質(zhì)量14倍的水分?？ɡz作為典型的親水膠體，含有豐富的強(qiáng)陰離子性硫酸酯基團(tuán)，可以與凝膠內(nèi)部和外部游離的水分子結(jié)合，形成氫鍵，最多可吸收自身質(zhì)量40～50倍的水分[12]，因此，在肌原纖維蛋白形成凝膠的過程中，添加卡拉膠可將肌原纖維蛋白凝膠體系中游離水轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰琢鲃铀疁粼谀z網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，顯著提高了復(fù)合凝膠的持水性能[13]。同時，添加SPI+CAG的復(fù)合凝膠兼具SPI和CAG的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的保水效果。

圖2 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of soy protein isolate and carrageenan on water holding property of myofibrillar gel

圖3 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響Fig.3 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the hardness and springness of myofibrillar gel

2.3 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合凝膠的硬度（圖3A）和彈性（圖3B）的變化如圖3所示。

由圖3A可知，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG的復(fù)合凝膠處理組硬度均顯著高于MP組（P＜0.05），且隨著添加量的增加，3種復(fù)合凝膠的硬度均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05），其中添加SPI的凝膠硬度增加最為顯著。當(dāng)最大添加量時，SPI、CAG和SPI+CAG的復(fù)合蛋白比MP分別提高了79%、63%和70%。由圖3B可知，添加SPI的凝膠彈性無顯著變化（P＞0.05），CAG和SPI+CAG復(fù)合凝膠的彈性均顯著高于MP（P＜0.05），且添加CAG復(fù)合凝膠在添加量為0.6%時差異顯著（P＜0.05），比MP提高了4%，而添加SPI+CAG復(fù)合凝膠在添加量為2.4%和3.6%時差異顯著（P＜0.05），比MP分別提高了4%和5%。肌原纖維蛋白在加熱過程中，蛋白受熱結(jié)構(gòu)打開會形成具有三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的凝膠基質(zhì)，可將水分子及其他組分束縛進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)中，而添加SPI的復(fù)合蛋白的加熱過程中，可將SPI截留進(jìn)蛋白凝膠基質(zhì)中，從而增加了凝膠的硬度和彈性[14]，同時，加熱后的SPI，其蛋白分子從天然狀態(tài)解折疊，亞基解離并形成部分的可溶性聚集體，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子內(nèi)及與水分子間的相互作用[12]。之前的研究表明卡拉膠作為一種陰離子多糖，能與肌原纖維蛋白分子發(fā)生相互作用，將蛋白有效地結(jié)合在卡拉膠形成的膠體體系內(nèi)，提高蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性[3]，此外，卡拉膠在蛋白凝膠形成過程，能吸收大量水分，將游離水分子束縛進(jìn)蛋白凝膠網(wǎng)格中，增強(qiáng)凝膠硬度和彈性。郝娟等[1]研究表明，大豆分離蛋白對雞肉腸的硬度的影響要遠(yuǎn)大于卡拉膠，這與我們的研究結(jié)果一致。

2.4 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

圖4為添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠白度的變化。

由圖4可知，除添加CAG對蛋白凝膠無顯著影響外（P＞0.05），添加SPI和SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠的白度值均低于MP凝膠對照組，并且隨著添加比例的增大，復(fù)合凝膠的白度值呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），添加SPI的復(fù)合凝膠白度值在2.4%和3.6%時顯著下降，較MP組降低了5%和6%，而SPI+CAG在3.6%時顯著下降，較MP組降低了4%。因為SPI本身呈現(xiàn)淡黃色，向MP凝膠中添加SPI會使得其白度值降低[15]，但SPI、SPI+CAG添加量較小時，其對凝膠白度影響不大。由于卡拉膠溶于水后形成澄清透明的溶液，將其加入到肌原纖維蛋白凝膠中對凝膠白度的影響不顯著[16]。從圖4中可看出，SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠的白度介于SPI和CAG復(fù)合凝膠之間，表明添加卡拉膠可在一定程度上減輕SPI對凝膠白度的影響，因此，由于SPI會對肌原纖維蛋白顏色有不利的影響，在肉制品生產(chǎn)加工應(yīng)用時應(yīng)適量添加。

圖4 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Fig.4 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the whiteness of myofibrillar gel

圖5 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of soy protein isolate and carrageenan on the microstructure of myofibrillar protein gels

2.5 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)的如圖5所示。

通過觀察復(fù)合凝膠電鏡圖發(fā)現(xiàn)，MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于松散，形成較大的不規(guī)則孔洞，蛋白質(zhì)排列雜亂，有明顯的斷層，蛋白間的交聯(lián)較稀疏：添加SPI的復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)較MP凝膠而言，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散無序程度降低，但仍存在較多孔洞。而添加CAG組凝膠結(jié)構(gòu)較為規(guī)則，孔洞也較?。禾砑覵PI+CAG凝膠結(jié)構(gòu)比較規(guī)則，無較多較大的孔洞，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較致密均勻，網(wǎng)格細(xì)小，蛋白質(zhì)間形成明顯交聯(lián)。由于大豆分離蛋白和卡拉膠復(fù)配具有較強(qiáng)的油-水結(jié)合能力，形成較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多糖的復(fù)合體系，這對于致密穩(wěn)定的蛋白凝膠形成有很大的促進(jìn)作用，因此，SPI+CAG復(fù)合蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)最好。相較之下，CAG組的凝膠結(jié)構(gòu)要比SPI組更規(guī)則致密，可能是卡拉膠結(jié)合水分子的能力要強(qiáng)于SPI，可以將更多的游離水分束縛進(jìn)凝膠結(jié)構(gòu)[12，16]，從而使蛋白網(wǎng)絡(luò)孔洞減少，形成較致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

通過對復(fù)合蛋白乳化特性、凝膠持水性、質(zhì)構(gòu)特性、白度和微觀結(jié)構(gòu)的測定，可得出，添加SPI、CAG及SPI+CAG復(fù)配物的復(fù)合蛋白，其乳化活性、乳化穩(wěn)定性、持水性和硬度均顯著高于MP（P＜0.05），且添加量越大，其增強(qiáng)效果越顯著；而添加SPI的彈性無明顯變化（P＞0.05），添加SPI+CAG復(fù)配物的彈性顯著增加（P＜0.05）；復(fù)合凝膠的白度值比MP有所下降，添加CAG的白度值無顯著差異（P＞0.05），而添加SPI顯著降低（P＜0.05）。觀察凝膠微觀結(jié)果可知，與MP相比，3種添加物均能改善復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)，使其趨于致密均勻，其中添加SPI+CAG復(fù)配物的效果最為顯著（P＜0.05）。

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