菌株Lactobacillus casei-16發(fā)酵豆?jié){的抗氧化特性研究

唐宇，張將，高原，李喚宇，張雨晴，宮悅，妥彥峰

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

隨著社會的發(fā)展，健康在人們的眼中變得越來越重要，如何活的更加健康已經(jīng)成為人們的重要議題。而很多研究發(fā)現(xiàn)，氧化對健康造成了很嚴(yán)重的影響。氧化損傷在很多常見疾病中均起到一定的作用，如癌癥、炎癥、免疫性疾病、心血管疾病等[1]。而且氧化也會導(dǎo)致機(jī)體處于亞健康的狀態(tài)[2]。人體內(nèi)氧化損傷主要是由氧化應(yīng)激反應(yīng)（自由基）造成的，人體內(nèi)95%的自由基為氧自由基[3]。

大豆原產(chǎn)于中國，現(xiàn)在已經(jīng)是世界上產(chǎn)量最高的農(nóng)作物之一[4]。而大豆中含有的大豆異黃酮是能夠?qū)θ梭w起到多種的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用的物質(zhì)，具有多種功能特性，其中就包含抗氧化作用[5]。除此之外大豆蛋白水解也能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的多種肽分子混合物[6]。因此大豆可以作為一種良好的抗氧化食物。吳非等[7]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆制品的抗氧化活性明顯高于非發(fā)酵豆制品；乳酸菌和霉菌發(fā)酵都能夠使豆乳的抗氧化活性提高，不同菌株提高的程度不同。翟齊嘯等[8]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可以通過改變豆乳中糖苷和苷元類物質(zhì)的組成來提高酸豆乳對鎘暴露導(dǎo)致氧化損傷的保護(hù)作用。徐寅等[9]對Streptococcus thermophilusgrx90發(fā)酵豆乳的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆乳的體外抗氧化性顯著的高于未發(fā)酵豆乳。

本試驗菌株為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點實驗室保存的5株菌，通過測定菌株發(fā)酵的效率、菌株發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的特性及豆?jié){清除DPPH自由基的特性，選出一株發(fā)酵豆?jié){綜合性能最好的菌株。提取其有效成分，用高效液相色譜分析發(fā)酵前后苷元型大豆異黃酮含量的變化、進(jìn)行氧化自由基吸收能力測定（Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC）及細(xì)胞抗氧化實驗等進(jìn)一步分析發(fā)酵豆?jié){提取物的抗氧化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆為大連市市售大豆；發(fā)酵菌株為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點實驗室保存菌株，如表1所示；HepG-2肝癌細(xì)胞，由國家海洋食品工程中心林松毅教授提供；亞甲藍(lán)購自美國Aladdin公司；冰醋酸（色譜純）購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、4-硝基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosidep-Nitrophenyl，pNPG）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、水溶性維生素E（Trolox）、熒光素鈉（Fluorescein sodium，F(xiàn)L）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪） 二鹽酸鹽（2，2 ′-Azobis （2-amidinopropane） dihydrochloride，AAPH）均購自于美國Sigma公司；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）購自于美國Gibco公司。

表1 試驗使用菌株Table 1 The strains of the experiment

1.2 主要儀器設(shè)備

KG-SX-500滅菌鍋：上海精密實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FQC生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S210-k精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；1510酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；FD-IC-5D冷凍干燥器：北京博醫(yī)實驗儀器有限公司；ScanVac真空濃縮儀：丹麥Labogene公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO公司；Waters 2695高效液相儀、PDA檢測器：美國Waters公司；200-PRO熒光酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；CKX41倒置電子顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株富集培養(yǎng)

試驗所用菌株均為-80℃保存（大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點實驗室提供）。凍存菌株37℃解凍，振蕩均勻后，取0.1 mL接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代2次后，于4℃保存待用。

1.3.2 豆?jié){發(fā)酵

用去離子水清洗大豆后，加入豆重2倍的水浸泡12 h，再加入4倍干豆重去離子水，進(jìn)行磨漿。用雙層紗布對磨好的豆?jié){進(jìn)行過濾。再將過濾后的豆?jié){，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在105℃條件下，滅菌15 min。待豆?jié){冷卻后接種豆?jié){體積分?jǐn)?shù)2%的菌液，于37℃發(fā)酵，發(fā)酵時間分別為6、12、18、24 h。測定不同發(fā)酵時間的pH值、β-葡萄糖苷酶活力、DPPH自由基清除能力，篩選出具有良好發(fā)酵特性及自由基清除能力的菌株，用于進(jìn)一步試驗。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活性測定

本文參考Zhai等[10-11]的方法，以4-硝基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物測定酶活力測定。分別取5株菌發(fā)酵 6 h、12 h、18 h、24 h的豆?jié){各 0.1 mL 加入0.2 mL 5 mmol/L pNPG（0.1 mol/L pH7.0，PBS緩沖溶液），37°C水浴加熱30 min，然后立即加入0.4 mL 4℃0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。于4℃條件下，10 000 r/min離心20 min，測定上清液405 nm吸光值。另外，取相同條件的反應(yīng)液（0.1 mL豆?jié){、0.2 mL pNPG溶液）立即置于沸水浴中加熱5 min滅活后加入5.0 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，作為空白對照。以對硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同濃度對硝基苯酚溶液在波長400 nm處的吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)、OD400為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位表示為U，是每分鐘催化形成一個微摩爾對硝基苯酚所需要的酶量。

式中：Um為單位體積樣品中β-葡萄糖苷酶活力，mU/mL；X為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后的對硝基苯酚濃度，μmol/L；V1為總反應(yīng)液體積，L；N 為稀釋倍數(shù)；T 為反應(yīng)時問，min；V2為樣品體積mL。

1.3.4 清除DPPH自由基的能力

測定DPPH自由基的清除能力，是一種常用的抗氧化特性測定法方法。試驗中通過測定5種菌不同發(fā)酵時間（6、12、18、24 h）清除 DPPH 自由基的能力來分析發(fā)酵豆?jié){的抗氧化能力，方法參照Yin J Y[12]的方法并加以修改；分別取5 mL豆?jié){和發(fā)酵豆?jié){與蒸餾水5 mL按照1∶1混合，在10 000 r/min，8℃條件下離心10 min。取1 mL離心上清液，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液，室溫下（20℃～25℃）放入黑暗的環(huán)境下反應(yīng)30 min；4 000 r/min離心10 min取上清，于517 nm測上清液吸光度。

按公式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100，式中：Ai為 1 mL DPPH+1 mL樣品的吸光度；Aj為1 mL蒸餾水+1 mL樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.5 發(fā)酵豆?jié){有效成分的提取

綜合分析發(fā)酵豆?jié){pH值、DPPH自由基清除率、β-葡萄糖苷酶活性的結(jié)果，從參與豆?jié){發(fā)酵的5株菌種中，篩選出一株發(fā)酵豆?jié){綜合性能最好的菌株，進(jìn)行豆?jié){的大量發(fā)酵并提取有效成分。

參考Yu-Fei的方法[13]，將發(fā)酵24 h豆?jié){和未發(fā)酵的豆?jié){于-30℃預(yù)凍，然后用凍干機(jī)凍干，用80%乙醇或水作提取液對豆?jié){凍干物進(jìn)行重溶，每克凍干產(chǎn)物，加20 mL的提取液，于室溫超聲萃取6 h，超聲功率為100 W。將超聲完畢的提取液離心取上清，條件為4℃，10 000 r/min離心10 min。乙醇提取液用真空濃縮儀凍干，水提取液用凍干機(jī)凍干，將提取物密封保存于-80℃冰箱中。

1.3.6 高效液相色譜測定大豆異黃酮

大豆苷元和染料木素是起主要抗氧化作用的大豆異黃酮，大豆苷和染料木苷是它們對應(yīng)的糖苷配體，通過測定發(fā)酵前后，這4種大豆異黃酮含量的變化來分析發(fā)酵豆?jié){抗氧化能力的改變。

將1.3.5中得到的提取物作為樣品分析其大豆異黃酮含量的變化，以4種大豆異黃酮（大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素）標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇配制成濃度為 10、20、50、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。用高效液相色譜儀分別測出這4種大豆異黃酮的樣品圖，以峰面積為橫坐標(biāo)、樣品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，并得到回歸方程。液相中所有試劑均需用0.22 μm濾膜過濾，以保證儀器的安全使用。

試驗采用Waters2695高效液相色譜儀，搭配2998PDA檢測器，色譜柱：SymmetryC18（5μm，4.6mm×250 mm）；流動相：A為0.5%冰醋酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫條件如表2所示；流速為1.000 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測波長為260 nm。

表2 梯度洗脫條件Table 2 The condition of the gradient elution

1.3.7 ORAC抗氧化能力指數(shù)測定

參考Huailing Wang等的方法[15-17]將1.2.5中得到的樣品稀釋至 0.2、0.15、0.1 mg/mL，取 20 μL 樣品加入到黑色96孔板中，再加入200 μL 0.96 μmol/L熒光素鈉（FL）。自動混勻37℃孵育5 min。加入20 μL 119.4 mmol/L AAPH，測量熒光值，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm，2 min測定一次，共60個循環(huán)，測定溫度為30℃。試驗中所有試劑均用75 mM pH 7.4的PBS溶解。試驗所得的各微孔不同時間點的絕對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)與其初始時間的熒光強(qiáng)度相比，折算成相對熒光強(qiáng)度f，以相對熒光強(qiáng)度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積（AUC）。式中：f0表示初始相對熒光強(qiáng)度；fn表示第n個測定點相對熒光強(qiáng)度。ORAC計算公式為：

樣品相對ORAC值=（AUC樣品-AUC空白）/AUC對照

式中：樣品組為 200 μL FL+20 μL AAPH+20 μL樣品；空白組為 200 μL FL+20 μL AAPH+20 μL PBS；對照組為 200 μL FL+40 μL PBS。

以 Trolox（6.25、12.5、25、37.5、50 μmol/L）濃度為橫坐標(biāo)，以其相對ORAC值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品的相對ORAC代入曲線，得出與該濃度下的樣品具有相同ORAC值的Trolox濃度，經(jīng)換算使樣品ORAC以Trolox當(dāng)量（微摩Trolox當(dāng)量/g）表達(dá)。

1.3.8 提取物保護(hù)HepG2細(xì)胞AAPH氧化損傷試驗

以人肝癌細(xì)胞HepG2為對象進(jìn)行發(fā)酵豆?jié){提取物的細(xì)胞抗氧化試驗。首先進(jìn)行提取物的細(xì)胞毒性試驗。將HepG2肝癌細(xì)胞接種到96孔板中，接種細(xì)胞濃度為4×105個細(xì)胞/mL，接種量為每孔100 μL，培養(yǎng)24 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗 2次，加入無胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入提取物，使其終濃度分別為 125、250、500 μg/mL，以未加提取物的作為對照。培養(yǎng)24 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，以亞甲藍(lán)染色法測定HepG2肝癌細(xì)胞存活率。亞甲藍(lán)染色法參考WOLFE[18]并加以修改：加入 50 μL 亞甲藍(lán)染液（98%HBSS、1.25% 戊二醛、0.6 g亞甲藍(lán)），37℃孵育1 h。吸去亞甲藍(lán)染液，去離子水輕輕浸沒，清洗6次。手甩干，剩余水分超凈臺風(fēng)干。然后每孔加入100 μL脫色液（50%乙醇、49%PBS、1%冰醋酸），室溫下利用孔板振蕩器振蕩20 min。測定在570 nm的吸光值。計算存活率：

存活率/%=樣品組吸光值/對照組吸光值×100

確定AAPH對HepG2肝癌細(xì)胞的半致死濃度：將HepG2肝癌細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞濃度為 2×105個細(xì)胞/mL，接種量為每孔 100 μL，培養(yǎng)24h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗 2 次，加入無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入AAPH溶液（無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基），使其終濃度分別為 50、60、70、75、80、85、90、100 mmol/L，以未加AAPH的作為對照，培養(yǎng)2 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，以亞甲藍(lán)染色法測定HepG2肝癌細(xì)胞存活率。

提取物對HepG2肝癌細(xì)胞AAPH氧化損傷的保護(hù)：將HepG2肝癌細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞濃度為2×105個細(xì)胞/mL，接種量為每孔100 μL，培養(yǎng) 24 h（5%CO2，37℃）后，用 pH7.4的 PBS 迅速清洗2次，加入無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入提取物（終濃度 125、250、500 μg/mL），37 ℃孵育1 h后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，添加無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基和AAPH（濃度為半致死濃度）。培養(yǎng)2 h（5%CO2，37℃）后，以不添加 AAPH 和提取物的為空白，以添加AAPH不添加提取物的作為對照，以亞甲藍(lán)染色法測定HepG2肝癌細(xì)胞存活率結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗中所有試驗至少重復(fù)3次，方差分析及差異顯著性分析（p＜0.05）采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，圖表采用OriginPro 8.5進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵豆?jié){pH測定結(jié)果

不同菌株發(fā)酵豆?jié){pH值變化情況見表3。

表3 不同菌株發(fā)酵豆?jié){pH值變化情況Table 3 The pH of the soymilk fermented by the different strains

如表3所示，在5株菌分別發(fā)酵豆?jié){過程中，經(jīng)菌株 L.sakei B2-4、E.gilvus B2-10、L.plantarum S2-6 發(fā)酵的豆?jié){pH值下降較緩慢：菌株L.casei-16、L.plantarum Y3-1發(fā)酵豆?jié){12 h，發(fā)酵豆?jié){的pH值基本穩(wěn)定，與發(fā)酵18、24 h后豆?jié){的pH相比無顯著差異（p＞0.05）：菌株 L.sakei B2-4、E.gilvus B2-10 發(fā)酵豆?jié){ 24 h時，發(fā)酵豆?jié){pH達(dá)到最低值，與L.casei-16、L.plantarum Y3-1發(fā)酵豆?jié){12 h的pH值無顯著差異（p＞0.05）。菌株L.casei-16、L.plantarum Y3-1發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)酸速度較快。

2.2 β-葡萄糖苷酶測定結(jié)果分析

大豆中存在的大豆異黃酮包含糖苷型（9種）和苷元型（3種）兩類，其中起主要抗氧化作用的染料木素（genistein）和大豆苷元（daidzein）均為苷元型大豆異黃酮，但大豆中異黃酮主要以糖苷形式存在，苷元型的大豆異黃酮僅占大豆中異黃酮總量的2%～3%[19-20]，β-葡萄糖苷酶能夠水解糖苷型異黃酮末端β-D-糖苷鍵，可以使糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型[21]，因此發(fā)酵菌株β-葡萄糖苷酶的活性越高，糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型大豆異黃酮的效率越高，所以可以通過測定發(fā)酵豆?jié){中菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力，來判斷菌體發(fā)酵豆?jié){的潛在抗氧化能力。

本試驗中5株乳酸菌均能在發(fā)酵豆?jié){過程中產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，但各菌株間所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性存在差異。不同菌株發(fā)酵豆?jié){不同階段的β-葡糖糖苷酶活性見表4。

表4 不同菌株發(fā)酵豆?jié){不同階段的β-葡糖糖苷酶活性Table 4 The β-glucosidase activity of the soymilk fermented by the 5 strains in different time mU/mL

由表4可知，隨著發(fā)酵時間延長，菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){的β-葡萄糖苷酶活性有一定增強(qiáng)，證明L.casei-16在0至24 h發(fā)酵階段能夠持續(xù)產(chǎn)酶。且當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時，其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活性顯著（p＜0.05）高于其它4菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性。因此推測L.casei-16發(fā)酵豆?jié){中苷元型大豆異黃酮含量較高，抗氧化活性較強(qiáng)。

2.3 DPPH自由基清除率

5株乳酸菌發(fā)酵豆?jié){對DPPH自由基清除能力見表5。

表5 不同菌株發(fā)酵豆?jié){DPPH自由基清除率Table 5 The DPPH free radical scavenging of the soymilk fermented by the different strains%

不同菌株發(fā)酵豆?jié){清除DPPH自由基清除能力存在差異，且隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵豆?jié){清除DPPH自由基清除能力發(fā)生變化。L.plantarum Y3-1發(fā)酵豆?jié){6 h至24 h，與未發(fā)酵豆?jié){相比，清除DPPH自由基清除能力未發(fā)生顯著變化（p＞0.05）：菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){ 18 h、24 h，L.sakei B2-4 發(fā)酵豆?jié){ 24 h，E.gilvus B2-10發(fā)酵豆?jié){24 h的DPPH自由基清除率顯著高于（p＜0.05）未發(fā)酵豆?jié){的清除率，而在這些發(fā)酵時間段，以上各菌的β-葡萄糖苷酶活性也較高，推斷在此階段發(fā)酵豆?jié){中苷元型大豆異黃酮含量較高。綜合分析L.casei-16發(fā)酵豆?jié){清除DPPH自由基的能力最好。

根據(jù)菌株發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)酸、β-葡萄糖苷酶活性及DPPH自由基清除率結(jié)果，選擇菌株L.casei-16進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 高效液相色譜測定大豆異黃酮結(jié)果分析

2.4.1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用高效液相色譜測定了大豆中普遍存在的4種大豆異黃酮，即大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4種標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間，分別為9.865、10.455、24.707min和31.780 min，如圖1所示。

圖1 4種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the isoflavones profile of 4 standard isoflavones

以峰面積作橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線得出4種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：

染料木苷：Y=0.019X+1.226，R2=0.999

大豆苷：Y=0.034X-0.271，R2=0.994

染料木素：Y=0.006X+2.622，R2=0.999

大豆苷元：Y=0.011X+2.519，R2=0.990

2.4.2 發(fā)酵豆?jié){中大豆異黃酮含量

分別利用80%乙醇和水作為提取劑，分別提取菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){、及未發(fā)酵豆?jié){提取物，通過高效液相色譜分析醇提物和水提物中4種大豆異黃酮的含量，結(jié)果如表6所示。

大豆異黃酮易溶于乙醇、甲醇及丙酮等有機(jī)溶劑。無論是菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){還是未發(fā)酵豆?jié){，醇提物中大豆異黃酮含量均高于水提物中大豆異黃酮含量。

從表6可以看出：豆?jié){發(fā)酵后苷元型大豆異黃酮染料木素和大豆苷元的含量較未發(fā)酵豆?jié){中的含量均有顯著（p＜0.05）提高，證明菌株L.casei-16可以通過發(fā)酵提高豆?jié){中苷元型大豆異黃酮的含量。

表6 豆?jié){提取物中大豆異黃酮含量Table 6 The concentration of the soybean isoflavone in the soybean milk extracts μg/g

2.5 ORAC抗氧化指標(biāo)

ORAC即抗氧化能力指數(shù)是通過熒光衰退曲線的保護(hù)面積與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)的保護(hù)面積相比得出。在目前抗氧化研究中為人們所常用的一種方法，該方法的準(zhǔn)確性、精密度及重復(fù)性相較于其他的抗氧化方法有一定的優(yōu)勢。該方法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，熒光素鈉（FL）為熒光指示劑，維生素E水溶性類似物Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用熒光微孔板分析儀進(jìn)行分析[16]。

表7 4種提取物的ORAC值Table 7 The ORAC of the 4 extracts μmol Trolox/g提取物

本試驗中，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的相對ORAC值為縱坐標(biāo)，獲得回歸方程：Y=0.747X-7.817，R2=0.997。

測定豆?jié){的熒光值，經(jīng)換算得到的ORAC值如表7所示。

如表7所示，L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提取物的ORAC值顯著（p＜0.05）高于水提取物的ORAC值和未發(fā)酵醇提物的ORAC值；對比L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提取物和水提物的ORAC結(jié)果可以判斷，易溶于甲醇的苷元型大豆異黃酮是發(fā)酵豆?jié){抗氧化物質(zhì)的重要組分之一；對比L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提取物與未發(fā)酵豆?jié){醇提物的ORAC結(jié)果，結(jié)合液相色譜分析結(jié)果，發(fā)酵提高了豆?jié){中抗氧化活性成分染料木素（genistein）和大豆苷元（daidzein）的含量。無論是菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){還是未發(fā)酵豆?jié){，醇提物中苷元型大豆異黃酮含量均高于水提物中苷元型大豆異黃酮含量含量，這可能解釋了醇提物的ORAC值均高于水提物ORAC值的原因。

表8 不同濃度提取物對HepG2肝癌細(xì)胞存活率的影響Table 8 The survival rate of the HepG2 cell at different concentrations of the extracts%

2.6 細(xì)胞抗氧化實驗結(jié)果

ORAC雖然能很好的體現(xiàn)提取物的抗氧化性，但是也有一定的局限性，ORAC屬于體外化學(xué)實驗，只能單純的測定出提取物中直接起抗氧化作用物質(zhì)的抗氧化能力，而不能反映細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)理的復(fù)雜性。有些本身不具有抗氧化性的物質(zhì)，卻可以通過調(diào)控機(jī)體生理作用來提高機(jī)體的抗氧化性，因此測定抗氧化最可靠的方法是人體實驗或小鼠實驗，但機(jī)體實驗從方便和經(jīng)濟(jì)的角度來說并不算優(yōu)秀。因此細(xì)胞實驗成為一種較為理想的實驗方法，它相較于體外化學(xué)實驗更接近于機(jī)體細(xì)胞的實際情況，相較于人體實驗或小鼠實驗更加便捷經(jīng)濟(jì)[22-23]。

進(jìn)行細(xì)胞實驗的前提是提取物對HepG2肝癌細(xì)胞沒有毒性，檢驗L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提取物、水提物及未發(fā)酵豆?jié){醇提物、水提物對HepG2肝癌細(xì)胞的毒性，每種提取物選擇3個濃度梯度（500、250、125 μg/mL），結(jié)果如表 8 所示。

由表8可知4種提取物的各濃度梯度對HepG2肝癌細(xì)胞均無細(xì)胞毒性。

2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）是常用的活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)劑，能夠在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定促進(jìn)ROS生成，使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[24-25]。因此本試驗以AAPH作為氧化劑，建立HepG2肝癌細(xì)胞的氧化損傷模型驗證4種提取物在機(jī)體內(nèi)的抗氧化效果。不同濃度AAPH處理2 h的HepG2肝癌細(xì)胞致死率如圖2所示。

圖2AAPH對HepG2肝癌細(xì)胞致死實驗結(jié)果Fig.2 The survival rate of the HepG2 cell at different concentrations of AAPH

表9 不同濃度提取物對AAPH半致死濃度下細(xì)胞存活率的影響Table 9 The survival rate of the HepG2 cells damaged by AAPH at different concentrations of the extracts%

由圖2可知，當(dāng)終濃度為85 mmol/L時，HepG2肝癌細(xì)胞的存活率為（48.87±3.48）%，最接近50%，因此細(xì)胞抗氧化實驗中AAPH的半致死濃度選擇為85 mmol/L

不同濃度的4種提取物對HepG2肝癌細(xì)胞氧化損傷模型的影響結(jié)果如表9所示。

未用提取物處理的細(xì)胞的存活率與未發(fā)酵豆?jié){水提物處理過的細(xì)胞的存活率沒有顯著差異（p＞0.05），表明未發(fā)酵豆?jié){水提物沒有抑制氧化損傷的效果：未發(fā)酵豆?jié){醇提物僅在終濃度為250 μg/mL時，有抑制氧化損傷的效果。而經(jīng)不同濃度的L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物和水提物處理的細(xì)胞存活率顯著（p＜0.05）高于未用提取物處理的細(xì)胞的存活率，證明了L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物和水提物均有抑制AAPH氧化損傷HepG2肝癌細(xì)胞的效果。

結(jié)合液相分析的結(jié)果來看，L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物中染料木素、大豆苷元的含量要顯著（p＜0.05）高于未發(fā)酵豆?jié){醇提物中的含量，說明了染料木素和大豆苷元是主要抗氧化活性成分[25]。L.casei-16發(fā)酵豆?jié){的醇提物及水提物均顯著（p＜0.05）提高了AAPH損傷HepG2肝癌細(xì)胞的存活率，同樣濃度下L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物和水提物的抗氧化能力無顯著性差異（p＞0.05）。但L.casei-16發(fā)酵豆?jié){的醇提物的苷元型大豆異黃酮含量均顯著（p＜0.05）高于L.casei-16發(fā)酵豆?jié){的水提物含量。因此推測出除苷元型大豆異黃酮發(fā)揮清除自由基的功能，可能存在其它L.casei-16發(fā)酵豆?jié){的產(chǎn)物，也起到了保護(hù)HepG2肝癌細(xì)胞免受AAPH損傷的效果。其中可能性最大的應(yīng)該是大豆多肽。乳酸菌可以分解大豆蛋白形成多肽，而大豆多肽具有抗氧化性[26-27]。

L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物和水提物的終濃度為500 μg/mL 時的細(xì)胞抗氧化效果顯著（p＜0.05）的高于終濃度為250、125 μg/mL時的效果，而終濃度為250、125 μg/mL 時，抗氧化效果無顯著差異（p＞0.05）。這說明濃度在250 μg/mL以下時，抗氧化作用的效果較差。

結(jié)合ORAC的結(jié)果來看，L.casei-16發(fā)酵豆?jié){醇提物的ORAC抗氧化效果和細(xì)胞抗氧化效果均顯著（p＜0.05）高于未發(fā)酵豆?jié){醇提物的效果。L.casei-16發(fā)酵豆?jié){水提物和未發(fā)酵豆?jié){水提物的ORAC效果無顯著（p＞0.05）差異，而L.casei-16發(fā)酵豆?jié){水提物的細(xì)胞抗氧化效果均顯著（p＜0.05）高于未發(fā)酵豆?jié){水提物的效果。具體原因有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

菌株L.casei-16發(fā)酵豆?jié){具有良好的抗氧化效果。通過L.casei-16發(fā)酵，豆?jié){中染料木素和大豆苷元的含量增加，從而使發(fā)酵豆?jié){抗氧化活性增強(qiáng)；L.casei-16發(fā)酵豆?jié){也可能產(chǎn)生其它代謝產(chǎn)物，具有抗氧化活性，還有待進(jìn)一步研究。

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