海人酸誘導(dǎo)的顳葉癲癇小鼠慢性期行為學(xué)變化△

鄭捷群 甘桐嘉 孫婷婷 王鵬舉 胡瑩瑩 許 浪

(武漢科技大學(xué)腦與認(rèn)知功能實(shí)驗(yàn)室 武漢 430065)

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在臨床上除了有癲癇癥狀的反復(fù)發(fā)作以外，還常伴有認(rèn)知功能的損傷和情緒改變，而這種改變并不會隨著癲癇發(fā)作的控制而得到改變[1～2]，因此越來越受到臨床工作的重視。其中，顳葉癲癇是很多見的一種治療難度大的癲癇，國內(nèi)顳葉癲癇模型行為學(xué)研究較少見。本實(shí)驗(yàn)旨在通過海人酸構(gòu)建小鼠顳葉癲癇模型觀察其在慢性發(fā)作期的行為改變，為研究顳葉癲癇對認(rèn)知功能和情緒的影響提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品

健康雄性成年小鼠(C57BL/6N)，4～5周齡，體重20～22g，從湖北省疾病預(yù)防控制中心購買。海人酸(購自Sigma公司)，行為學(xué)圖像采集和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)儀器購自上海欣軟公司。

1.2 構(gòu)建模型和動物分組

小鼠腹腔注射海人酸(10mg/kg,1mg/ml)，引發(fā)癲癇急性發(fā)作，按照Racine標(biāo)準(zhǔn)[3]給小鼠抽搐的水平分級，3級及以上為造模成功，為實(shí)驗(yàn)組(未達(dá)到3級的，1h后重復(fù)注射(2mg/kg,1mg/ml)直至發(fā)作達(dá)到3級為止)。注射后持續(xù)觀察5h，對于連續(xù)抽搐保持1h不能自行恢復(fù)的腹腔注射鎮(zhèn)靜劑地西泮(4mg/kg)使其緩解。對照組用0.9%的生理鹽水(10ml/kg)腹腔注射。在相同環(huán)境下飼養(yǎng)2個月后，兩組各選取40只實(shí)驗(yàn)(n=40)。每項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組各10只小鼠。

1.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1定位航行訓(xùn)練

前5d，兩組小鼠逐個從水池的十字分割的四個象限中點(diǎn)處背向池中央放入池中，記錄每只小鼠從四個象限出發(fā)尋找到水中可視平臺的平均時間，計為逃避潛伏時間。

1.3.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)

最后一天，移走可視平臺。

用相同的方法將兩組小鼠放入池中，記錄每個小鼠在前5d所在的象限滯留的時間，計為目標(biāo)象限滯留時間。

1.3.2條件恐懼實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1聲音聯(lián)系恐懼訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)

第1d，小鼠暴露在隔離箱里適應(yīng)120s后，給予聲音刺激30s并在最后兩秒足部電擊(0.7mA)2s，間隔20s，重復(fù)聲音及電刺激循環(huán)10次。

1.3.2.2場景聯(lián)系恐懼記憶實(shí)驗(yàn)

第2d，將小鼠放入第1d實(shí)驗(yàn)的環(huán)境中180s，記錄小鼠在此場景中的僵直時間，計算場景聯(lián)系僵直時間百分比(僵直時間百分比=僵直時間/180s)。

1.3.2.3聲音聯(lián)系恐懼記憶實(shí)驗(yàn)

第3d，用酒精擦洗隔離箱并用泡沫板墊底，將實(shí)驗(yàn)動物放入箱中適應(yīng)120s后給予聲音刺激180s，記錄小鼠受到聲音刺激后的聲音聯(lián)系僵直時間百分比(僵直時間百分比=僵直時間/180s)。

1.3.3曠場實(shí)驗(yàn)

內(nèi)壁黑色的無頂盒子，規(guī)格為72cm×72cm×30cm，盒子底部被圖像采集系統(tǒng)劃分為25個正方形小格，小鼠從正中央的小格放入，開始實(shí)驗(yàn)，記錄5min內(nèi)活動總路程、中央?yún)^(qū)(四周無墻壁的小格)滯留時間、大小便次數(shù)。

1.3.4高架十字實(shí)驗(yàn)

十字迷宮的兩對臂互相垂直交叉擺放，臂長度為28cm，寬度是5cm，閉臂周圍有10cm高的圍墻，每只小鼠被放于開臂和閉臂相交處，小鼠背對閉臂開始實(shí)驗(yàn)，記錄5min內(nèi)小鼠在開臂活動的時間比(在開臂的活動時間比=停留于開臂時間/5min)，小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)比(進(jìn)入開臂次數(shù)比=進(jìn)入兩開臂次數(shù)/進(jìn)入四個臂總次數(shù))，進(jìn)入總次數(shù)(進(jìn)入四個臂總次數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1定位航行訓(xùn)練

兩組的逃避潛伏時間均逐漸減少，顯示兩組小鼠均具備學(xué)習(xí)能力。第1、2d，兩個組的逃避潛伏期無差別；后3d，實(shí)驗(yàn)組小鼠的時間明顯比對照組長，差異極具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1，表1。

圖1 定位航行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)

組別例數(shù)1d2d3d4d5d對照組1054．80±2．6047．70±2．4034．00±2．0029．80±1．8021．80±1．00實(shí)驗(yàn)組1055．60±2．8049．60±2．6141．80±2．4037．20±2．0035．20±1．80

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組的滯留時間為(16.96±0.85)s，明顯短于對照組小鼠的(24.90±1.25)s，差異具有極顯著性，見圖2。

圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)

2.2 條件恐懼實(shí)驗(yàn)

2.2.1場景聯(lián)系記憶實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組小鼠僵直時間百分比是(17.50±0.88)%，明顯小于對照組小鼠的僵直時間百分比(60.24±3.01)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 場景聯(lián)系僵直百分比

2.2.2聲音聯(lián)系記憶實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的僵直時間百分比為(49.01±2.45)%,明顯小于對照組僵直時間百分比(79.57±3.98)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 聲音聯(lián)系僵直百分比

2.3 曠場實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組活動路程(39728.464±1986.423)mm顯著長于對照組的活動路程(30164.815±1508.241)mm，差異有顯著性(P<0.01)，見圖5。實(shí)驗(yàn)組中間區(qū)域滯留時間(27.068±1.353)s短于對照組的(34.523±1.726)s，有顯著差異(P<0.01)，見圖6。實(shí)驗(yàn)組大小便次數(shù)(6.125±0.306)次明顯多于對照組的(2.750±0.138)次，有極顯著差異，見圖7。

圖5 礦場活動路程

圖6 中間區(qū)域滯留時間

圖7 大小便次數(shù)

2.4 高架十字實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入開臂的次數(shù)百分比是(32.00±1.60)%，對照組是(30.00±1.5)%，兩者無明顯差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組開臂停留時間百分比是(31.00±1.55)%，對照組開臂停留時間百分比是(28.59±1.43)%，兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8～9。但實(shí)驗(yàn)組與對照組的進(jìn)入開臂和閉臂的總次數(shù)(25.75±1.29)次、(33.00±1.65)次比較，有極顯著差異(P<0.05)，見圖10。

圖8 開臂活動時間百分比

圖9 開臂進(jìn)入次數(shù)百分比

圖10 開臂閉臂進(jìn)入總次數(shù)

3 討論

動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚩陀^地評估實(shí)驗(yàn)動物模型的行為，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究[4～5]。其中，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[6～7]大多時候被用來觀察小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示癲癇鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較正常鼠明顯下降，這也與孫欽建[8]、錢若兵[9]等的研究結(jié)果相同。已有研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇患者腦結(jié)構(gòu)磁共振成像中[10～11],腦結(jié)構(gòu)的硬化病變波及海馬旁回，杏仁核等具備認(rèn)知功能部分。KA誘導(dǎo)的癲癇小鼠也出現(xiàn)類似的病理變化，此結(jié)果與臨床患者表現(xiàn)一致，說明海人酸致顳葉癲癇小鼠行為學(xué)變化與顳葉癲癇患者的臨床表現(xiàn)有高度吻合性，這為顳葉癲癇的研究提供了途徑。條件恐懼實(shí)驗(yàn)是對小鼠情緒記憶的測試[12]，通過場景和聲音提示引發(fā)小鼠僵直的表現(xiàn)從而判斷恐懼情緒的出現(xiàn)。結(jié)果顯示，癲癇小鼠的情緒記憶能力明顯減弱，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與顳葉癲癇的腦組織損傷以海馬區(qū)域?yàn)橹飨嚓P(guān)，并且海馬是被認(rèn)為與空間記憶緊密聯(lián)系的[13]，而受損傷的杏仁核在恐懼記憶形成的回路中也占重要地位。該結(jié)果與蔡國恩等[12]的匹魯卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇表現(xiàn)相似。曠場試驗(yàn)中癲癇小鼠自發(fā)行為增多，探索行為減少，情緒更緊張，可以判定癲癇小鼠的焦慮抑郁狀態(tài)[14～16]更明顯。此結(jié)果在癲癇的戊四氮點(diǎn)燃模型中也有體現(xiàn)[17]。高架十字是用來分析動物焦慮表現(xiàn)的一個重要實(shí)驗(yàn)[18～19]，結(jié)果顯示癲癇鼠開臂進(jìn)入次數(shù)和滯留時間與對照組無差異，只在進(jìn)入兩種臂的總次數(shù)上有所減少。有趣的是，該結(jié)果與前述曠場實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組焦慮樣行為變化明顯相矛盾，這可能與小鼠所處的環(huán)境不同，產(chǎn)生焦慮緊張的原因不同有關(guān)[20]，這種結(jié)果也可能與癲癇慢性發(fā)作期焦慮情緒的補(bǔ)償機(jī)制導(dǎo)致焦慮有所抑制有關(guān)，因?yàn)楦呒苁謱?shí)驗(yàn)環(huán)境中小鼠處于風(fēng)險決策性應(yīng)答狀態(tài)[21]，具體有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢性持續(xù)的癲癇狀態(tài)會明顯導(dǎo)致小鼠的行為學(xué)改變，具體表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的降低和焦慮緊張情緒的上升，這對更深入的組織和分子層面的研究有引導(dǎo)意義。

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