白蛾周氏嚙小蜂普通氣味受體OR1的進化分析

張新玥 ，王鳳竹 ，范偉健 ，潘麗娜 ，朱耿平 ，林艷平 ，王 靜 ，李 敏

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；3.漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心，河南 漯河 462300)

周氏嚙小蜂(Chouioia cunea Yang)為世界性檢疫害蟲美國白蛾(Hypanthia cunea Drury)蛹期重要的內(nèi)寄生性天敵，以寄主蛹中的血淋巴、器官和營養(yǎng)物質(zhì)為食，其卵期、幼蟲期和蛹期均在寄主蛹體內(nèi)度過，發(fā)育至老熟幼蟲期時在寄主的蛹?xì)ぶ谢迹笥鸹龇鋄1].周氏嚙小蜂的繁殖量大，寄生范圍廣，在林木害蟲生物防治方面有廣闊的應(yīng)用前景[2-3].寄生蜂在自然界中找尋寄主時主要依靠嗅覺系統(tǒng).嗅覺系統(tǒng)由氣味劑結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensoryneuronmembraneprotein，SNMP)、氣味受體(olfactoryreceptors，ORs)、氣味降解酶(odordegrading enzymes，ODEs)等蛋白共同參與[4]，其中，氣味受體ORs為G蛋白耦聯(lián)受體，分布在嗅覺感覺神經(jīng)元樹突的膜表面，氣味分子或氣味分子與氣味結(jié)合蛋白OBPs的復(fù)合物通過激活對應(yīng)的氣味受體ORs傳遞嗅覺信號，使昆蟲產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)[5].一般將ORs分為兩類：一類為普通氣味受體(conventional odorant receptor，ORs)，在不同昆蟲間保守性較低；另一類為非典型氣味受體(olfactory receptor co-receptor，ORco)，通常命名為OR83b受體，在不同昆蟲間的同源性較高，可與普通ORs共表達形成異源二聚體，從而提高對外界氣味分子的敏感度[6-7].

趙燕妮等[8]首次對C.cunea觸角轉(zhuǎn)錄組進行測序并得到了80個CcORs，并且對CcOR83b進行了分子進化分析[9]，在此基礎(chǔ)上，王鳳竹等[10]對CcOBPI進行了進化分析.本研究從周氏嚙小蜂觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定了一個普通氣味受體OR1的cDNA全序列，對該基因進行了多角度的進化分析，為深入了解OR1的功能和進一步探究C.cunea的嗅覺機制提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

以中國遼寧鞍山柞蠶養(yǎng)殖基地的柞蠶(Antheraea pernyi)蛹為白蛾周氏嚙小蜂的替代寄主，于PQX-350H人工氣候箱(中儀國科(北京)科技有限公司)中進行傳代培養(yǎng).周氏嚙小蜂飼養(yǎng)條件：溫度為25℃，相對濕度為70%，光照周期為14 h∶10 h(白天∶夜晚).取當(dāng)日羽化活力強健的雌性及雄性周氏嚙小蜂觸角，每200頭小蜂觸角貯存于一個1.5mL離心管中，搜集8管樣品后立即浸于RNA later(AM7020，美國Ambion公司)中，-20℃下保存.由華大基因科技服務(wù)有限公司(http：//www.genomics.cn/index)進行轉(zhuǎn)錄組測序.

1.2 基因序列分析

利用Illumina HiSeqTM2000平臺對周氏嚙小蜂觸角樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，使用Trinity軟件對單個讀取序列片段進行聚類后拼接成Unigene，結(jié)合生物信息學(xué)軟件得到目標(biāo)序列cDNA全長.應(yīng)用BioEdit7.2.1分析序列的氨基酸殘基數(shù)量及其相對分子質(zhì)量，使用EXPASY平臺中的Signal P 3.0 Serve程序(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件預(yù)測氨基酸序列信號肽的位置 ， 使 用 HMMTop(http：//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域.

在NCBI上對OR1進行BLASTs搜索，選擇匹配分值(Maxscore)大于170且與目標(biāo)序列相似度高的18條膜翅目同源序列，分別為短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)OR2-like[XM_014379607]([XP_014235093]括號里為對應(yīng)蛋白質(zhì)序列號，下同)、麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)OR236[NM_001190663]([NP_001 177592])、紅火蟻(Solenopsis invicta putative)OR85d[XM_011167977]([XP_011166279])、小火蟻(Wasmannia auropunctata) OR49b-like[XM_011709094]([XP_01 1707396])、埃氏扁胸切葉蟻(Vollenhoviaemeryi)OR49blike[XM_012027062]([XP_011882452])、 紅 收 獲 蟻(Pogonomyrmex barbatus)OR49b-like[XM_011641626]([XP_011639928])、東方大黃蜂(Bombus impatiens)OR49b-like[XM_003486857]([XP_003486905])、弓 背蟻(Camponotus floridanus)OR9a-like[XM_011254156]([XP_011252458])、歐洲熊蜂(Bombusterrestris)OR13alike[XM_003401107]([XP_003401155])、多胚跳小蜂(Copidosoma floridanum)OR49b-like[XM_014350606]([XP_014206092])、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)OR141[KT246483]([ALR87041])、切葉蟻(Acromyrmex echinatior) OR49b-like[XM_011050838]([XP_0110491 40])、子彈蟻(Dinoponera quadriceps)putative OR85d[XM_014626390]([XP_014481876])、 苜 蓿 切 葉 蜂(Megachile rotundata)putative OR92a[XM_003705930]([XP_003705978])、美洲大頭阿塔切葉蟻(Atta cephalotes)OR49b-like[XM_012202902]([XP_012058292])、對葉榕傳粉榕小蜂(CeratosolensolmsimarchaliOR2-like[XM_011503526]([XP_011501828])、意大利蜜蜂(Apis mellifera)OR13-like[XM_006563582]([XP_006563645])、排蜂(Apisdorsata)putativeOR56a-like[XM_006608094]([XP_006608157]).

應(yīng)用BioEdit7.2.1進行序列比對，應(yīng)用EMBOSS Pairwise Alignment Algorithm(http：//www.ebi.ac.uk/emboss/align/)分析氨基酸序列的一致性和相似性．

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在GenBank上收集膜翅目18條同源序列數(shù)據(jù)的蛋白序列以及外群黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)OR47a[AEB91932]、CcOR1共20 條序列，BioEdit7.2.1比對后使用 MEGA 6.0 鄰接法(neighbor-joining，NJ)[11]和最大似然法(maximum likelihood methods，ML)[12]構(gòu)建氨基酸進化樹，節(jié)點支持率通過自舉檢驗法(bootstrap methods)進行評估，重復(fù)次數(shù)1000，其他設(shè)為默認(rèn)參數(shù).

1.4 選擇壓力分析

使用 Single Likelihood Ancestor Counting(SLAC)軟件包(http：//www.datamonkey.org/)對 OR1 基因進行選擇壓力檢測.將來自GenBank上膜翅目的18條同源序列與OR1序列一并在線提交，利用鄰接法(neighbor joining tree)構(gòu)建祖先序列，計算非同義替代與同義替代的比值Ka/Ks(即dN/dS)．利用雙尾法檢驗得出P值(P＜0.05為樣本相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為相關(guān)性具有高度統(tǒng)計學(xué)意義)．

1.5 替代速率

使用MEGA6.0 Nei-Gojobori(Proportion)方法[13]計算所得核苷酸序列的非同義替代速率(Ka)和同義替代速率(Ks)[14].將周氏嚙小蜂與18種膜翅目昆蟲進行同源序列比對，所有比對gap成對刪除．

1.6 密碼子使用偏好性

通過內(nèi)嵌于DnaSP version 4.0[15]的Effective Number of Codons(ENC)[16]、Codon Bias Index(CBI)[17]和Scaled Chi-square(Scaled χ2)[18]3 種方法分析 OR1 及其同源基因的密碼子偏好性.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

經(jīng)觸角轉(zhuǎn)錄組測序及序列聚類拼接后，成功得到含完整開放閱讀框的OR1基因的cDNA(GenBank登錄號：KX264502)，其長度為 1 257 bp，編碼 418 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為47 985.42.軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于第33～57、72 ～91、130 ～147、182 ～206、295 ～314、345 ～363 和395～414位氨基酸殘基上.

周氏嚙小蜂OR1氨基酸序列與其他18種膜翅目昆蟲之間的一致性范圍是26.1%～75.7%，與短管赤眼蜂和麗蠅蛹集金小蜂的一致性較高，數(shù)值約為75%，與其他昆蟲的一致性為30%左右；與18種膜翅目昆蟲氨基酸之間的相似性范圍為46.1%～86.2%，仍與短管赤眼蜂和麗蠅蛹集金小蜂的相似性數(shù)值最高，約為85%，與其他昆蟲的相似性約為50%.

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示.由圖1可以看出，周氏嚙小蜂OR1與短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum Or2-like首先聚為一支，即周氏嚙小蜂與短管赤眼蜂的親緣關(guān)系最近，與多胚跳小蜂、麗蠅蛹集金小蜂等寄生蜂的親緣關(guān)系較為接近.

圖1 根據(jù)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of amino acid sequences

2.3 選擇壓力分析

分析周氏嚙小蜂與其他18種膜翅目昆蟲的OR基因編碼區(qū)受到的選擇壓力，得到平均Ka/Ks(即dN/dS)值為0.658 943，即整個編碼區(qū)主要接受負(fù)選擇.在0.1的顯著性水平上檢測到5個正選擇位點和33個負(fù)選擇位點；在0.2的顯著水平上檢測到26個正選擇位點和72個負(fù)選擇位點．

2.4 替代速率

分析19條序列的非同義與同義替代速率，共得到核苷酸位點1 506個，其中有1 261個核苷酸位點存在變異，簡約信息位點(parsimony information sites)共1 036個，單突變位點(single ton sites)共 167個.將寄主廣泛的周氏嚙小蜂及寄主專一小蜂分別與非寄生性的膜翅目昆蟲相比較，分析替代速率，結(jié)果如表1所示.

表1 OR1同源基因的同義及非同義替代速率Tab.1 Synonymous and non-synonymous divergence of OR1 genes

由表1可以看出，寄主廣泛的周氏嚙小蜂、短管赤眼蜂、麗蠅蛹集金小蜂和多胚跳小蜂與膜翅目非寄生性昆蟲之間的同義分異差異范圍為0.634～0.759，非同義分異差異范圍為0.466～0.548.寄主專一的對葉榕傳粉榕小蜂與膜翅目非寄生性昆蟲之間的同義分異差異范圍為0.621～0.806，非同義分異差異范圍為0.488～0.539.

2.5 密碼子使用偏好性分析

分析19條序列的密碼子偏好性，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，寄主廣泛的周氏嚙小蜂、短管赤眼蜂、麗蠅蛹集金小蜂和多胚跳小蜂密碼子偏好性指數(shù)(CBI)均小于30%，寄主專一的對葉榕傳粉榕小蜂的密碼子偏好性相對較大.周氏嚙小蜂密碼子第2位的G+C含量(G+C2)在5種寄生性小蜂中差異較小，第3位的G+C含量(G+C3)在寄主廣泛的4種小蜂中較高，而對于寄主專一的小蜂來說含量較小，因此造成了G+C總含量不等.

表2 OR1同源基因的密碼子偏好性Tab.2 Estimates of codon bias in OR1 genes

3 討論

分析氣味受體的進化趨勢可以更好地了解氣味結(jié)合蛋白的功能.本研究從周氏嚙小蜂觸角的轉(zhuǎn)錄組中得到了一個普通氣味受體OR1的cDNA全序列，使用HMMTop軟件預(yù)測其氨基酸序列，結(jié)果顯示周氏嚙小蜂OR1具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，符合昆蟲氣味受體具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的典型特點[19].昆蟲氣味蛋白家族龐大且高度分化.例如果蠅的各個嗅覺受體基因的同源性為17%～26%，極少數(shù)昆蟲才可達到40%～60%[20-21].將周氏嚙小蜂的OR1氨基酸序列與18種膜翅目昆蟲進行比對，發(fā)現(xiàn)其一致性和相似性的范圍較大，在不同昆蟲之間有高度分異.其中，周氏嚙小蜂OR1與麗蠅蛹集金小蜂OR236的一致性和相似性最高，分別為75.7%和86.2%；其次是與短管赤眼蜂OR2-like的一致性及相似性較高，分別為74.3%和82.9%，這與構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果大致相符.氨基酸建樹時，周氏嚙小蜂先與短管赤眼蜂OR2-like聚合，之后與麗蠅蛹集金小蜂OR236聚成一支，節(jié)點支持率較高，證明其親緣關(guān)系較近.

周氏嚙小蜂與18種膜翅目昆蟲的OR基因的平均Ka/Ks值為0.658 943，整個編碼區(qū)主要受負(fù)選擇壓力的影響，即進化速率緩慢，具有功能分化的潛力[22].但在顯著性為0.1及以上時，與非典型氣味受體基因OR83b相比[9]，周氏嚙小蜂OR1基因的正選擇位點較多，可能意味著在物種形成過程中該基因受到了某些選擇壓力的影響.位點的特異性分析為基因進化提供了某些證據(jù)，受正向選擇作用的位點可能在氣味分子傳遞與結(jié)合方面起到了重要作用[23]，這也可解釋傳統(tǒng)ORs與非典型的OR83b基因之間生物學(xué)功能上的差異或許是由某些特異性選擇位點決定的.

為了維持基因功能的保守性，在負(fù)選擇壓力作用下，大部分基因的非同義替代速率會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同義替代速率[24]，這與所得替代速率結(jié)果相符.從同義突變率的結(jié)果中可以看出，相對于寄主單一的榕小蜂，周氏嚙小蜂與其他寄主廣泛小蜂的同義突變率相對較低，說明作用于該物種的基因受自然選擇影響較大.所有昆蟲物種的非同義突變率很相似，證明負(fù)選擇壓力對該基因作用的強弱程度一致.密碼子的使用差異性一般可以反映出自然選擇的強度，基于對19種昆蟲密碼子偏好性的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寄主廣泛的周氏嚙小蜂顯示出了較低的密碼子偏好性，由于承受的進化約束力不同，寄主單一的寄生蜂密碼子偏好性高可能是由于選擇壓力造成的，且專一寄生蜂和寄主廣泛寄生蜂在反映中性同義突變程度的密碼子第3位上的G+C含量方面相差較大，往往也暗示了選擇壓力的強弱有差別[24].

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