神經(jīng)干細(xì)胞外泌體對(duì)低氧所致神經(jīng)元凋亡的抑制作用*

黎 博， 魏紅艷， 楊 焰， 尹美嫻， 胡春林， 盧遠(yuǎn)征， 孫占朋， 廖曉星△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1急診科， 2衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510080)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新和多能分化潛能，在治療缺血缺氧性腦病上有很大的前景[1]。外泌體(exosomes，Exo)是一種被細(xì)胞釋放出細(xì)胞外的生物囊泡，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞。幾乎所有的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞都會(huì)釋放外泌體，并具有其來源母細(xì)胞的某些特征。有大量文獻(xiàn)報(bào)道干細(xì)胞釋放的外泌體能作用于受損靶細(xì)胞產(chǎn)生治療作用[2]，而神經(jīng)干細(xì)胞的外泌體是否能改善低氧狀態(tài)下神經(jīng)元的損傷尚未見相關(guān)報(bào)道。本文擬初步探討神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體是否能減少氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)誘導(dǎo)的缺氧模型中神經(jīng)元的凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)元的存活。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠(孕13.5 d)和SPF級(jí)SD大鼠新生鼠(0～1 d)均由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2011-0029。

2 主要試劑

DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM basic (1×) 高糖培養(yǎng)基、谷氨酰胺、胎牛血清、B27、表皮生長因子(epidermal growthfactor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、Accutase細(xì)胞消化液、胰蛋白酶和青、鏈霉素雙抗購自Gibco;多聚L-賴氨酸、阿糖胞苷和CoCl2購自Sigma；免疫細(xì)胞化學(xué)染色用小鼠抗大鼠nestin和微管相關(guān)蛋白2(microtube-associated protein 2, MAP2)單克隆抗體，ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X, Alix)和腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)兔抗大鼠Western blot抗體購自Abcam；Hoechst 33342和TUNEL凋亡試劑盒購自Roche；CCK-8試劑盒購自Dojindo;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自Thermo。

3 主要方法

3.1NSCs的提取、培養(yǎng)和鑒定 取孕13.5 d的SD大鼠胚胎，在冰PBS中機(jī)械分離海馬組織，離心法收集細(xì)胞，并將其重懸于DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中，添加20 mg/L EGF、20 mg/L bFGF、1% B27、2 mmol/L谷氨酰胺、5×103U/L 青霉素和5 mg/L鏈霉素。細(xì)胞以2×108/L的密度種植在25 cm2培養(yǎng)瓶中，每2～3 d半量換液，根據(jù)細(xì)胞的生長情況5～7 d傳代1次，傳至第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。第3代NSCs培養(yǎng)7 d后在同樣的培養(yǎng)基中種植在多聚賴氨酸包被的玻片上，約4 h細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定，用0.3%的Triton X-100通透細(xì)胞，并用10%的BSA封閉，用小鼠抗大鼠nestin抗體4 ℃作用16 h，用于標(biāo)記NSCs的中間絲蛋白，再用熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594室溫下作用2 h，用Hoechst 33342染核后，封片固定，用熒光顯微鏡檢測(cè)。

3.2神經(jīng)元的提取、培養(yǎng)和鑒定 取0～1 d的SD大鼠新生鼠，在冰PBS中機(jī)械分離大腦皮層組織，剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后，離心法收集細(xì)胞，并將其重懸于DMEM basic (1×)高糖培養(yǎng)基中，添加試劑有10%胎牛血清和0.1%雙抗。細(xì)胞以5×108/L種植在預(yù)先用多聚賴氨酸包被的6孔板中入細(xì)胞培養(yǎng)箱。4 h后，若細(xì)胞貼壁良好，可換為Neurobasal-A培養(yǎng)基，添加2% B27、1%的谷氨酰胺和標(biāo)準(zhǔn)半量的雙抗。培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定，用0.3%的Triton X-100通透細(xì)胞，并用10%的BSA封閉，用小鼠抗大鼠MAP2抗體4 ℃作用16 h，再用熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594室溫下作用2 h，用Hoechst 33342染核后，封片固定，用熒光顯微鏡檢測(cè)。

3.3外泌體的提取 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后開始收集細(xì)胞上清液。將收集的上清液用0.22 μm過濾器過濾后，使用第1次超高速離心[使用70Ti定角轉(zhuǎn)子，貝克曼超高速離心機(jī)(型號(hào)Optima L-100XP)，離心參數(shù)設(shè)置為100 000×g，4 ℃，70 min]，離心結(jié)束后移除上清液，底部留0.5 cm左右液體(第1次超高速離心可能看不到沉淀)，用1 mL PBS清洗離心管側(cè)壁，收取清洗離心管后的PBS，使用第2次超高速離心[換用SW40水平轉(zhuǎn)子，貝克曼超高速離心機(jī)(型號(hào)Optima L-100XP)，離心參數(shù)設(shè)置為100 000×g，4 ℃，70 min]，離心結(jié)束后移除上清液，用100 μL的PBS重懸離心管底部沉淀，置于-80 ℃冰箱保存[3]。

3.4透射電鏡制樣 取10 μL外泌體樣本加在200目銅網(wǎng)上待外泌體自行沉淀，30 min后用吸水紙吸去多余液體，滴加鎢磷酸負(fù)染，3 min后用吸水紙吸去多余鎢磷酸，即可以80 kV電壓上機(jī)觀察。

3.5實(shí)驗(yàn)分組 為探討CoCl2對(duì)神經(jīng)元存活率的影響，使用200、400和600 μmol/L 3種不同濃度的CoCl2干預(yù)24 h，誘導(dǎo)神經(jīng)元缺氧損傷，探討最佳致缺氧損傷濃度，建立神經(jīng)元缺氧損傷模型。為探討外泌體是否能促進(jìn)損傷組神經(jīng)元的存活并減少凋亡，將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為正常對(duì)照(control)組、400 μmol/L CoCl2+外泌體(CoCl2+Exo)組和400 μmol/L CoCl2+與外泌體等體積的PBS(CoCl2+PBS)組，后2組中的外泌體(35 mg/L)和PBS均在CoCl2造模24 h后替換培養(yǎng)基時(shí)加入，再干預(yù)24 h后換正常培養(yǎng)基并測(cè)神經(jīng)元存活率和凋亡率。將提取的原代神經(jīng)元以每孔1×107/L接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5 d，采用200、400和600 μmol/L不同濃度的CoCl2處理神經(jīng)元24 h后與CCK-8共孵育4 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A)，按公式計(jì)算神經(jīng)元相對(duì)活力：相對(duì)活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A-空白組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%。

3.6qNano測(cè)外泌體粒徑分布 安裝納米孔板，調(diào)試儀器至納米孔板內(nèi)無任何氣泡。取1 μL標(biāo)準(zhǔn)顆粒，加專用Buffer 1 mL以稀釋1 000倍，用0.22 μm濾器過濾后備用；取5 μL外泌體，加PBS 45 μL以稀釋10倍，0.22 μm濾器過濾，即可加樣上機(jī)測(cè)試，每次上樣量為30 μL，測(cè)試粒子數(shù)量400個(gè)左右(本實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)試的粒子數(shù)量為370個(gè))即可點(diǎn)擊停止按鈕，待儀器自動(dòng)處理數(shù)據(jù)并生成粒徑分布圖。

3.7TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 神經(jīng)元接種于多聚賴氨酸包被的玻片上，加上述不同濃度的CoCl2處理24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X-100透膜，0.1%檸檬酸鈉孵育后，用TUNEL混合液染色，再用Hoechst 33342染核，封片固定， 熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡。凋亡指數(shù)(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

3.8Western blot檢測(cè)蛋白表水平 取外泌體20 μL進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)后，加入Alix、TSG101抗體以及相應(yīng)HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，ECL進(jìn)行顯色，暗室X膠片顯影，拍照后進(jìn)行條帶灰度分析。

3.9BCA法測(cè)定蛋白濃度 BCA工作液根據(jù)待測(cè)孔數(shù)按A液∶B液=50∶1的比例配制；將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋到 0.5 g/L，按 0、1、2、4、8、12、16和20 μL的量將標(biāo)準(zhǔn)品加入對(duì)應(yīng)的孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 μL；每孔加 2 μL待測(cè)樣品，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到 20 μL；每孔加 200 μL BCA工作液，37 ℃孵育 30 min；用酶標(biāo)儀測(cè)出各孔的A562，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件分析。計(jì)量資料表示方法為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠胚胎海馬組織來源的NSCs培養(yǎng)和鑒定

大鼠胚胎海馬組織來源的NSCs在DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基中可迅速增殖，培養(yǎng)3～5 d后可形成神經(jīng)球。免疫熒光染色示我們提取的細(xì)胞可表達(dá)nestin，這表明我們提取的細(xì)胞具有NSCs特性，見圖1。

Figure 1. Identification of the cultured NSCs by observing the immunofluorescence of nestin (×400).

圖1神經(jīng)干細(xì)胞的nestin免疫熒光鑒定圖

2 SD大鼠新生鼠的神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定

新生鼠原代神經(jīng)元接種 4 h 后貼壁良好，在倒置顯微鏡下可觀察到貼壁細(xì)胞呈圓形，折光性好，表面光滑；之后神經(jīng)元逐漸長出軸突與樹突；4～5 d 時(shí)細(xì)胞間的軸突、樹突相互交織形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。免疫熒光染色示我們提取的細(xì)胞可表達(dá)MAP2，這表明我們提取的細(xì)胞具有神經(jīng)元特性，見圖2。

3 NSCs來源外泌體的特征鑒定和蛋白濃度測(cè)定

NSCs傳至第3代以后開始收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液，按上述方法提取外泌體。在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)呈“杯口”狀，見圖3A，直徑約100 nm；Western blot顯示外泌體表面可表達(dá)Alix和TSG101這2種表面分子標(biāo)志物，見圖3B；qNano測(cè)外泌體的粒徑分布，粒徑為(95.0±23.5) nm (n=370)，見圖4。經(jīng)BCA法蛋白濃度測(cè)定得知90 mL的神經(jīng)干細(xì)胞上清液可提取出的外泌體平均蛋白濃度為(699.4±40.2) mg/L (n=3)。

Figure 2. Identification of the cultured neurons by observing the immunofluorescence of MAP2 (×400).

圖2神經(jīng)元的MAP2免疫熒光鑒定圖

Figure 3. The characterization of NSCs-derived exosomes. A: transmission electron microscopy observation of whole-mounted exosomed; B: Western blot analysis identified the exosome marker Alix and TSG101 in the exosome. Mean±SD.n=3.

圖3神經(jīng)干細(xì)胞外泌體的電鏡圖和表面蛋白標(biāo)志物

Figure 4. The size distribution of exosomes from the NSC-conditioned medium by nanoparticle analysis (qNano).

圖4神經(jīng)干細(xì)胞外泌體的粒徑分布圖

4 CoCl2對(duì)神經(jīng)元活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示,隨CoCl2濃度的增加，神經(jīng)元活力逐漸下降(P<0.05)，200、400和600 μmol/L CoCl2作用24 h，神經(jīng)元的相對(duì)活力分別是78.7%±3.9%、48.1%±2.7%和34.6%±3.4%; 400 μmol/L CoCl2處理神經(jīng)元，隨作用時(shí)間的延長，神經(jīng)元的活力逐漸下降(P<0.05), 400 μmol/L CoCl2作用12 h、24 h和48 h，神經(jīng)元的相對(duì)活力分別是62.9%±3.9%、52.3%±3.2%和24.1%±2.1%，見圖5。故我們選取400 μmol/L CoCl2作用于神經(jīng)元24 h作為損傷組用于后續(xù)研究。

Figure 5. The viability of neurons exposed to different concentrations of CoCl2for 24 h (A) or 400 μmol/L CoCl2for different time (B) detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs 0 μmol/L group;#P<0.05vs0 h group.

圖5CoCl2對(duì)神經(jīng)元活力的影響

5 外泌體對(duì)神經(jīng)元凋亡和存活的影響

TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果顯示，CoCl2+外泌體組的凋亡率較CoCl2+PBS組明顯降低(P<0.05)，見圖6A、B。CCK-8結(jié)果顯示，CoCl2+外泌體組神經(jīng)元活力較CoCl2+PBS組顯著升高(P<0.05)，見圖6C。

Figure 6. The effects of exosomes on the apoptosis and viability of the neurons exposed to CoCl2. A: the images of TUNEL staining (×200); B: the quantitative analysis of A; C: the cell viability measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs400 μmol/L CoCl2+PBS group.

圖6外泌體抑制損傷組神經(jīng)元的凋亡并促進(jìn)存活

討 論

CoCl2可誘導(dǎo)多種細(xì)胞缺氧損傷，本研究結(jié)果顯示CoCl2對(duì)神經(jīng)元的半抑制濃度是400 μmol/L。綜合其它研究報(bào)道可知，CoCl2對(duì)不同細(xì)胞的致?lián)p傷濃度不一定相同。用100 μmol/L CoCl2作用7 d可使少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞發(fā)生慢性缺氧性損傷；200 μmol/L CoCl2可用于建立肝癌細(xì)胞缺氧模型[4]；400 μmol/L CoCl2可用于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的缺氧模型[5]。以上結(jié)果表明，400 μmol/L CoCl2可誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，并用于建立神經(jīng)元低氧損傷模型。

本研究結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體可表達(dá)外泌體標(biāo)志物Alix和TSG101。有文獻(xiàn)報(bào)道，TSG101會(huì)在外泌體表面表達(dá)而在小囊泡(microparticles)表面不表達(dá)[6]。目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為外泌體的的直徑大約為(100±20) nm，這與本研究的結(jié)果一致。另有報(bào)道認(rèn)為，外泌體的形態(tài)在冷凍蝕刻電鏡上觀察為更符合生理現(xiàn)象的“圓球”狀，而在透射電鏡上則呈現(xiàn)“杯口”狀，原因是透射電鏡樣本的制作過程中會(huì)使外泌體發(fā)生脫水皺縮現(xiàn)象，故使得外泌體的“圓球”狀變成了“杯口”狀[7]。綜合以上特征，可確定我們提取出來的物質(zhì)為外泌體。

外泌體作為細(xì)胞分泌出細(xì)胞外的囊泡，參與細(xì)胞與細(xì)胞之間信息的傳遞，其可攜帶脂質(zhì)蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA和mRNA等物質(zhì)在血液、體液和培養(yǎng)液中自由擴(kuò)散，并被受體細(xì)胞攝取，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。大量文獻(xiàn)報(bào)道了干細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)其受體細(xì)胞具有保護(hù)作用[8-9]，如心肌球樣細(xì)胞分泌的外泌體可以改善豬在急性心肌梗塞下的心肌存活數(shù)量，并抑制心肌的凋亡[10]。外泌體用于藥物治療作用和藥物載體的功能越發(fā)得到重視[11-12]。神經(jīng)元作為永久細(xì)胞，在受到損傷后往往很難修復(fù)，神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化為神經(jīng)元的能力雖為神經(jīng)元的再生提供了希望，但受損部位惡劣的微環(huán)境為干細(xì)胞的中遠(yuǎn)期生存提出較大的挑戰(zhàn)。雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)為外泌體的穩(wěn)定性提供了一定的保障，使其能在惡劣的微環(huán)境中穩(wěn)定存在，發(fā)揮其母細(xì)胞的某些生理作用并改善微環(huán)境以改善實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。有研究表明，在大鼠的腦創(chuàng)傷疾病中，通過靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源的外泌體可穿過血腦屏障進(jìn)入腦組織，通過改善大腦微環(huán)境發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)再生作用，并明顯促進(jìn)神經(jīng)血管的重塑以改善神經(jīng)功能[13]。體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體可減少氧糖剝奪模型中神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制可能與外泌體中包裹的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和其它的抗氧化酶激活神經(jīng)元內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞的外泌體可促進(jìn)低氧狀態(tài)下神經(jīng)元的存活并減少凋亡，這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體保護(hù)作用趨勢(shì)一致。目前尚未有關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體在神經(jīng)元急性缺氧損傷中的應(yīng)用及治療效果的文獻(xiàn)報(bào)道，此為本研究的意義所在。

外泌體在被發(fā)現(xiàn)之初的十余年間都因被認(rèn)為是細(xì)胞的“排泄物”而不受重視，伴隨全世界研究的進(jìn)展逐步發(fā)現(xiàn)外泌體的生物相容性、穩(wěn)定性、載體作用等特征使其在疾病的診斷和治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。神經(jīng)干細(xì)胞外泌體相關(guān)的研究尚屬缺乏，相信隨著對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞及其外泌體研究的逐步深入，也會(huì)開發(fā)出干細(xì)胞相關(guān)外泌體在神經(jīng)缺氧損傷上的新型治療手段。

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