人參皂苷Rg1通過抑制Wnt/β-catenin通路促進退變?nèi)搜甸g盤髓核細胞的生長及胞外基質(zhì)合成

魯 花， 于 露， 甄歡歡， 劉汝銀， 岳宗進

(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院脊柱科， 河南 鄭州 450002)

腰椎間盤突出是以椎間盤退變?yōu)橹饕卣鞯囊环N常見病、多發(fā)病，也是腰腿痛的重要起因之一[1]。由于腰椎間盤的組織再生能力有限，退變后較難逆轉(zhuǎn)[2]。人腰椎間盤髓核細胞(human lumbar nucleus pulposus cells，HNPCs)是人體腰椎間盤髓核組織的唯一構(gòu)成細胞，嚴重影響著腰椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展[3]。腰椎間盤退變可直接導致髓核細胞數(shù)量減少和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成減少[4]。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)作為傳統(tǒng)中藥人參的有效成分，具有促進海馬神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)可塑性、抗衰老、提高免疫和輔助抗腫瘤等作用[5]。在體外，可通過細胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)來模擬體內(nèi)髓核細胞退變的微環(huán)境[6-7]。有報道證實，人參皂苷Rg1能通過抑制細胞凋亡保護腦部缺血再灌注損傷[8]，提示其對病理損傷下的細胞具有一定的保護作用。但是，人參皂苷Rg1在HNPCs退變中是否也具有積極的保護作用尚不明確。因此，本文擬探究人參皂苷Rg1對退變HNPCs生長和ECM合成的影響，并進一步研究其可能的作用機制，以期為腰椎間盤突出患者的臨床治療在尋找新的藥物靶點方面提供初步的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

HNPCs購于ScienCell；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶等均購于HyClone；人參皂苷Rg1購于中國食品藥品鑒定研究院；LiCI購于Sigma；CCK-8試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；Real-time PCR 試劑盒購于Invitrogen；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司合成；Annexin V-FITC檢測試劑盒購于Trevigen；Caspase-3活性試劑盒和Western blot所用抗體均購于Abcam；ECL發(fā)光試劑盒購自Amersham。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)和OGD模型的構(gòu)建 HNPCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當皿底細胞融合至80%時，用胰蛋白酶消化后按照3∶1的比例進行傳代培養(yǎng)。構(gòu)建HNPCs的OGD模型來模擬人體內(nèi)的腰椎間盤髓核細胞的退變微環(huán)境，將HNPCs培養(yǎng)基換為無血清的無糖DMEM培養(yǎng)基，于1% O2/ 94% N2/ 5% CO2氣體組分中培養(yǎng) 12 h。根據(jù)細胞分組，將LiCl以20 μmol/L 的濃度添加到培養(yǎng)基中用來激活Wnt/β-catenin信號通路。4 d左右第1次換液，每隔2 d換液1次，發(fā)現(xiàn)細胞開始貼壁后于光學顯微鏡下進行形態(tài)觀察。

2.2Real-time PCR檢測Ⅱ型膠原(collagen II)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)和Ki67的mRNA水平 按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，collagen II的上游引物序列為5’-GCTCCCAGAACATCGCCTACC-3’，下游引物序列為5’-TGAACCTGCTATTGCCCTCT-3’；aggrecan的上游引物序列為5’-AGTCCTCAAGCCTCCTGTA-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCTCGCCAGTGTAG-3’，β-actin的上游引物序列為5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’，下游引物序列為5’-GGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’。按照試劑盒的說明書進行PCR擴增，擴增條件為預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min、退火60 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)2-ΔΔCt法計算各樣本mRNA的相對表達量。

2.3Western blot檢測collagen II、aggrecan和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達 將各組細胞按照每孔4×105的密度接種于6孔板，24 h后換液，進行無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后采用BCA法進行蛋白定量，各取30 μL 樣品進行SDS-PAGE，再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入I 抗為鼠抗人的collagen II、aggrecan、β-catenin、c-Myc、cyclin D1 和β-actin(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜。加入HRP標記的兔抗鼠 II 抗(1∶10 000)37 ℃ 孵育45 min，用 ECL液顯影，使用化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，隨后結(jié)果采用Image-Pro Plus 6軟件(Media Cybernetics)分析，以待測蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

2.4CCK-8實驗檢測細胞活力 將各組細胞按照每孔2×105個的密度接種于96孔板中，用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。每組設(shè)5個復孔，待細胞長至80%融合時，分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h加入20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)24 h，于酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)值。取5孔A值的平均數(shù)，按照下列公式計算細胞相對活力:細胞相對活力(%)=處理組A/對照組A×100%。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組細胞按照每孔4×105個的密度接種到6孔板，12 h后換液，進行24 h無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。預冷PBS洗滌，加入預冷75%乙醇，4 ℃固定4 h以上。離心棄上清，PBS洗滌后，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-EGFP孵育15 min，再加入5 μL propidium iodide (PI)混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。1 h內(nèi)，在FC-500流式細胞儀上使用Beckman CXP軟件檢測細胞凋亡情況。

2.6Caspase-3試劑盒檢測caspase-3活性 將各組細胞按照每孔2×105的密度接種于96孔板中，12 h后換液，進行24 h無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按照說明書進行操作，比色法測定caspase-3活性，用分光光度計在405 nm處檢測吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組比較采用單因素方差分析，隨后各組均數(shù)間的兩兩比較通過SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 正常HNPCs和退變HNPCs的形態(tài)觀察

光鏡觀察結(jié)果顯示，正常HNPCs培養(yǎng)4 d左右大部分細胞開始貼壁，細胞形態(tài)多以類圓形和短梭形為主，胞質(zhì)豐富，突起呈現(xiàn)短而粗的特點；與HNPCs組相比，經(jīng)過OGD模擬的退變HNPCs在6 d后才發(fā)現(xiàn)貼壁生長，細胞突起延長，形態(tài)為明顯的長梭形，胞質(zhì)減少且細胞生長滯緩，見圖1。

Figure 1. The morphological changes of normal HNPCs and degenerative HNPCs observed under optical microscope (×100).

圖1正常和退變HNPCs的形態(tài)變化

2 人參皂苷Rg1促進退變HNPCs中collagen II 和aggrecan的表達

Real-time PCR結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞中特異性標志物collagen II 和aggrecan表達均顯著減少(P<0.05)，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可顯著增加collagen II 和aggrecan表達(P<0.05)。Western blot結(jié)果同樣顯示，不同劑量人參皂苷Rg1均可增加OGD組細胞collagen II 和aggrecan的蛋白表達，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，提示其可促進OGD下細胞中ECM的合成，見圖2。

3 人參皂苷Rg1增加退變HNPCs的活性

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞活性明顯降低，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可明顯升高OGD組細胞活性(P<0.05)，見圖3A。Real-time PCR結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞中增殖標志蛋白Ki67的mRNA水平顯著減少，不同劑量人參皂苷Rg1均可增加OGD組細胞Ki67的mRNA表達，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖3B。

4 人參皂苷Rg1減少退變HNPCs的凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞凋亡總數(shù)增加，而25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L人參皂苷Rg1可減少OGD組細胞凋亡比例(P<0.05)，見圖4A、B。Caspase-3試劑盒檢測結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞中的caspase-3活性顯著升高，不同劑量人參皂苷Rg1均可降低OGD組細胞caspase-3活性，高劑量的人參皂苷Rg1作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖4C。

Figure 2. The mRNA and protein expression levels of collagen II and aggrecan were detected by real-time PCR and Western blot analysis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖2人參皂苷Rg1對退變HNPCs中collagenII和aggrecan表達的影響

Figure 3. Effect of ginsenoside Rg1 on the viability of degenerative HNPCs.A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the mRNA level of Ki67 was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖3人參皂苷Rg1對退變HNPCs活力的影響

5 Wnt/β-catenin信號通路在人參皂苷Rg1改善HNPCs退變中的作用

Western blot實驗結(jié)果顯示，與HNPCs組相比，OGD組細胞中β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白均被顯著激活，100 μmol/L人參皂苷Rg1可有效降低β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白的表達，而給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl可逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rg1發(fā)揮的下調(diào)作用(P<0.05)，見圖5A、B。同樣的，在OGD組細胞中，LiCl可顯著緩解人參皂苷Rg1引起的細胞活力增加、細胞凋亡比例減少及collagen II 和aggrecan表達升高(P<0.05)，見圖5C～F。

討 論

人參是中國傳統(tǒng)中草藥，人參皂苷Rg1作為其主要的藥效成分，被證實是相對安全和有效的藥物，對正常的組織并無不良影響，因而被應(yīng)用于治療各種疾病[9]。人參皂苷Rg1藥理作用廣泛，特別是其可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，在腫瘤的治療方面具有較高的藥用價值[10]。近期文獻報道證實，人參皂苷Rg1可劑量依賴性改善大鼠的神經(jīng)損傷癥狀，對受缺血再灌注損傷的大鼠腦部具有一定的保護作用[8]。已知體外細胞的OGD處理可模擬體內(nèi)的缺血再灌注損傷[11-12]，而且，體外OGD的HNPCs也可用來模擬退變HNPCs的微環(huán)境[6]，因此，本文擬探討人參皂苷Rg1是否對退變HNPCs有一定改善療效。

首先，在體外培養(yǎng)HNPCs并構(gòu)建OGD的HNPCs模型，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，證實OGD后的HNPCs細胞貼壁較晚，生長緩慢， 形態(tài)由類圓形變?yōu)殚L梭形，胞質(zhì)明顯減少，成功構(gòu)建退變HNPCs模型，為后續(xù)實驗研究奠定基礎(chǔ)和依據(jù)。腰椎間盤退變可顯著減少髓核細胞ECM的合成，而ECM主要由collagen II 和aggrecan構(gòu)成[1]。本文實驗證實，基質(zhì)合成相關(guān)標志分子collagen II 和aggrecan在OGD處理的HNPCs中顯著降低，而不同濃度的人參皂苷Rg1可明顯增加 collagen II 和aggrecan的表達，提示人參皂苷Rg1可促進退變HNPCs的ECM合成。

Figure 4. Effect of ginsenoside Rg1 on the apoptosis of degenerative HNPCs.A: the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the quantitative analysis of A; C: the caspase-3 activity was measured by a caspase-3 analysis kit. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group.

圖4人參皂苷Rg1對退變HNPCs凋亡的影響

Figure 5. Role of Wnt/β-catenin pathway in the inhibitory effect of ginsenoside Rg1 on degeneration of HNPCs.A: the representative images of the Western blot for determining the protein levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1; B: the quantitative analysis of A; C: the cells activity was measured by CCK-8 assay; D: the cells apoptosis was analyzed by flow cytometry; E: the protein expression of collagen II was determined by Western blot; F: the protein expression of aggrecan was determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHNPCs group;#P<0.05vsOGD group;&P<0.05vsOGD+100 μmol/L ginsenoside Rg1 group.

圖5Wnt/β-catenin信號通路在人參皂苷Rg1抑制HNPCs退變中的作用

細胞的增殖和凋亡是判斷細胞生長狀況的根本指標，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可增加退變HNPCs的活力，且增加增殖蛋白Ki67的表達，顯著促進退變HNPCs的增殖。同時，人參皂苷Rg1可減少退變HNPCs的凋亡，降低caspase-3的活性，顯著抑制退變HNPCs的凋亡。這提示人參皂苷Rg1可有效促進退變HNPCs的生長，緩解其退變速度。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控細胞生長、發(fā)育的關(guān)鍵途徑[13-14]。有文獻證實，激活的Wnt/β-catenin信號通路可引起椎間盤細胞的胞外基質(zhì)分解，抑制HNPCs增殖，誘導HNPCs凋亡，引發(fā)細胞退變[15]。本實驗表明，退變HNPCs中Wnt/β-catenin信號通路被激活，通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc和cyclin D1均表達上調(diào)，人參皂苷Rg1可顯著下調(diào)通路蛋白的表達，而通路激活劑LiCl可顯著扭轉(zhuǎn)人參皂苷Rg1抑制的Wnt/β-catenin的活化。除此之外，LiCl也可減弱人參皂苷Rg1對退變HNPCs生長和ECM合成的影響。此結(jié)果提示，人參皂苷Rg1對退變HNPCs的生長和ECM合成的調(diào)控很可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而實現(xiàn)。

本文證實，人參皂苷Rg1可通過負向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進退變HNPCs的生長和ECM合成，從而有可能改善人腰椎間盤退變中髓核細胞的功能。因此，本研究將為延緩人腰椎間盤退變的治療提供一個新的方向。

[參考文獻]

[1] 顧海倫, 劉 莉, 王 歡, 等. Ad-BMP-2和Ad-TGF-β1共轉(zhuǎn)染人退變椎間盤髓核細胞對細胞外基質(zhì)代謝的影響[J]. 生物醫(yī)學工程與臨床, 2009, 13(1):58-61.

[2] 劉海飛, 王德春, 胡有谷. 椎間盤退行性變的生物學治療研究進展[J]. 中華外科雜志, 2006, 44(4):284-287.

[3] 吳 畏, 章海均, 顧志謙, 等. 紫檀芪通過促進Nrf2核轉(zhuǎn)移在調(diào)節(jié)髓核細胞炎癥反應(yīng)中的作用[J]. 中國細胞生物學學報, 2016, 38(10):1214-1221.

[4] 王大武, 胡偵明, 郝 杰, 等. 沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1通過Akt/PKB通路抑制人退變椎間盤髓核細胞凋亡[J]. 生物化學與生物物理進展, 2012, 39(6):563-573.

[5] 韓路拓, 任鈞國, 楊佳妹, 等. 人參皂苷Rg1對高糖培養(yǎng)的心肌成纖維細胞Wnt信號通路的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報, 2014, 37(11):758-762.

[6] Liu J, Wang J, Zhou Y. Upregulation of BNIP3 and translocation to mitochondria in nutrition deprivation induced apoptosis in nucleus pulposus cells[J]. Joint Bone Spine, 2012, 79(2):186-191.

[7] 魯 花, 于 露, 甄歡歡, 等. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9激活PI3K/Akt信號通路抑制退變髓核細胞的炎癥反應(yīng)和凋亡[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2016, 38(18):2047-2052.

[8] 王巧云, 劉 鳳, 吳峰階, 等. 人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬p-ERK1/2與p-JNK表達的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(2):2229-2234.

[9] 楊 逸, 楊麗瑛, 戴景峰, 等. 人參皂苷Rg1藥理活性的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2012, 23(12): 3121-3123.

[10] 趙保勝, 劉 洋, 徐暾海, 等. 人參皂苷Rg1對人胃癌BGC-823的抑制作用研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2011, 16(4):361-365.

[11] Sang GH, Shim J, Choi EJ. CIIA negatively regulates neuronal cell death induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 397(1):139-146.

[12] 劉 晶, 陳 曼, 董瑞瑞, 等. Ghrelin在腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)修復過程中的作用和機制[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(10):1861.

[13] 朱將虎. 經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在神經(jīng)干細胞增殖和分化中的作用[J]. 重慶醫(yī)學, 2016, 45(34):4858-4860.

[14] 張應(yīng)花, 鄧曉慧, 王中平, 等. 丙戊酸孤獨癥大鼠腦中經(jīng)典Wnt信號通路的變化[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(8):1394-1399.

[15] 杜立龍, 徐寶山, 楊 強. 椎間盤退變信號轉(zhuǎn)導機制的研究進展[J]. 中國脊柱脊髓雜志, 2013, 23(12):1119-1122.