右美托咪定減輕失血性休克/復(fù)蘇大鼠急性腎損傷*

姜遠(yuǎn)旭， 夏明珠， 黃 強(qiáng)， 戴中亮， 李亞麗， 張中軍△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院麻醉科， 深圳市麻醉醫(yī)學(xué)工程研究中心, 2深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)湖貝社區(qū)健康服務(wù)中心， 廣東 深圳 518020)

出血性休克及其復(fù)蘇(hemorrhagic shock/resuscitation，HS/R)容易引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致多器官損傷[1]。腎臟是失血性休克后主要受損的器官之一。研究表明，右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有抗炎及抗氧化作用[2-3]，并對內(nèi)毒素血癥及缺血再灌注誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用[2， 4]，但右美托咪定是否能通過抗炎及抗氧化作用對HS/R誘導(dǎo)的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究旨在觀察右美托咪定對出血性休克/復(fù)蘇大鼠誘導(dǎo)的AKI的影響，為臨床治療出血性休克合并AKI病人提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥物和試劑

右美托咪定(批號12071234，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β， IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(Santa Cruz)。

2 方法

2.1模型制備和分組 SPF級雄性Wistar大鼠32只,體重180～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證編號為44007200047364。實驗前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射3℅戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，股靜脈置入24#套管供實驗中補(bǔ)液和給藥。頸部備皮后用碘伏消毒，分離右頸總動脈，插管作動脈壓監(jiān)測、放血和采集血標(biāo)本。大鼠隨機(jī)分為4組：(1) 生理鹽水正常對照組(NS組，n=8)：股靜脈注射 NS 5 mL/kg。 (2)右美托咪定組(D組，n=8): 股靜脈持續(xù)輸注右美托咪定5 μg·kg-1·h-1。(3) 失血性休克/復(fù)蘇模型組(HS/R組，n=8)：通過頸總動脈放血(0.025 mL/kg, 超過10 min)，將血壓降至40～50 mmHg，并將放出的血液保存于干燥的肝素抗凝試管中，記錄放出的血液容積。維持休克狀態(tài)期間若MAP超過50 mmHg，則放出部分血液，若MAP低于40 mmHg時，則回輸部分失血。維持休克狀態(tài)60 min后，回輸采集的剩余血液及2倍的生理鹽水(超過10 min)進(jìn)行復(fù)蘇。(4)右美托咪定治療組(HS/R+D組，n=8): 容量復(fù)蘇后60 min，股靜脈持續(xù)輸注DEX 5 μg·kg-1·h-1。DEX持續(xù)輸注6 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉后開腹，暴露下腔靜脈，采集血標(biāo)本，室溫靜置30 min，4 ℃，2 500×g離心10 min，取上清備用，隨即放血處死動物，完整取出腎臟，在冰面上取部分腎臟液氮中速凍后放入-70 ℃低溫冰箱保存；取部分腎臟用10%中性多聚甲醛固定24 h后，用于病理學(xué)檢查。

2.2平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)的監(jiān)測 頸總動脈插入套管針后，連接監(jiān)護(hù)儀，穩(wěn)定20 min 后，記錄基礎(chǔ)MAP，休克期間每15 min 記錄 1 次MAP，復(fù)蘇后每隔1 h 記錄 1 次，直到實驗結(jié)束。

2.3血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)和血清肌酐(creatinine，Cr)濃度的檢測 取上述血清，血生化分析儀檢測BUN和Cr的濃度。

2.4腎組織TNF-α和IL-1β含量的檢測 取冰凍腎組織解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定腎組織 TNF-α和IL-1β含量，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2.5腎組織MDA含量及SOD活性檢測 取腎組織100 mg解凍，制備腎組織勻漿用試劑盒測定腎組織中MDA含量和SOD活性。

2.6Western blot檢測腎組織HO-1和NF-κB的表達(dá) 分別取適量的腎組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收取上清液，蛋白定量并煮沸15 min。應(yīng)用10% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS + 20% Tween 20(TBST)溶液對膜封閉1.5 h；封閉完畢后用TBST室溫下脫色搖床上洗膜3次,每次10 min，洗膜后加入HO-1或NF-κB 的I抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；TBST室溫下脫色搖床上洗膜3次，每次10 min，加入 II 抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)，室溫下孵育2 h，TBST室溫下脫色搖床上洗膜3次，每次10 min，最后加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)對蛋白條帶掃描分析，根據(jù)各組蛋白吸光度與β-actin吸光度的比值表示HO-1或NF-κB 蛋白的相對表達(dá)量。

2.7腎組織病理學(xué)檢查 取部分腎組織用10%中性甲醛固定24 h后,給予脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。Nikon Eclipse Ti-S顯微鏡200倍鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MAP的變化

與NS組相比，HS/R組在2～6 h時點的MAP降低(P<0.05)；與HS/R組比較，HS/R+D組在2～6 h時點的MAP升高(P<0.05)；而D組的變化與NS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

Figure 1. The effects of dexmedetomidine (D) on MAP of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖1右美托咪定對各組大鼠MAP的影響

2 血清Cr和BUN 濃度的變化

與NS組相比，HS/R組的BUN和Cr濃度升高(P<0.05)；與HS/R組比較， HS/R+D組的BUN和Cr濃度降低(P<0.05)；D組的變化和NS組類似，見圖2、3。

3 腎組織TNF-α和IL-1β含量的變化

與NS組相比，HS/R組的TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)；與HS/R組比較， HS/R+D組的TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05)；而D組的變化和NS組類似，見圖4、5。

4 腎組織MDA含量及SOD活性的變化

與NS組比較，HS/R組的MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與HS/R組比較，HS/R+D組的MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)；而D組的變化和NS組類似，見圖6、7。

Figure 2. The effects of dexmedetomidine (D) on BUN in the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

圖2右美托咪定對各組大鼠BUN的影響

Figure 3. The effects of dexmedetomidine (D) on serum Cr in the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖3右美托咪定對各組大鼠血清Cr的影響

Figure 4. The effects of dexmedetomidine (D) on TNF-α content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

圖4右美托咪定對各組大鼠腎組織TNF-α含量的影響

5 腎組織NF-κB和HO-1表達(dá)的變化

與NS組相比，HS/R組的NF-κB表達(dá)增加(P<0.05)；與HS/R組比較，HS/R+D組的NF-κB表達(dá)降低(P<0.05)；而D組的變化和NS組類似，見圖8。

與NS組比較，HS/R組腎組織的HO-1表達(dá)升高(P<0.05)；與HS/R組比較，HS/R+D組腎組織的HO-1表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，而D組的變化

Figure 5. The effects of dexmedetomidine (D) on IL-1β content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group．

圖5右美托咪定對各組大鼠腎組織IL-1β含量的影響

Figure 6. The effects of dexmedetomidine (D) on MDA content in the kidney tissues of rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖6右美托咪定對各組大鼠腎組織MDA含量的影響

Figure 7. The effects of dexmedetomidine (D) on SOD activity in the kidney tissues of rats induced hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖7右美托咪定對各組大鼠腎組織SOD活性的影響

和NS組類似，見圖9。

6 腎組織病理學(xué)檢查

NS組的腎組織結(jié)構(gòu)基本正常；HS/R組的腎小管管腔擴(kuò)張，近曲小管上皮細(xì)胞扁平，核染色邊界稍不清，小管間血管充血，核泡變性，可見炎性細(xì)胞浸潤；HS/L+D組的腎小管管腔稍擴(kuò)張，小管上皮形態(tài)尚保存，血管充血，間質(zhì)有少許炎性細(xì)胞浸潤，見圖10。

Figure 8. The effect of dexmedetomidine (D) on NF-κB expression in the kidney of the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖8右美托咪定對各組大鼠腎組織NF-κB表達(dá)的影響

Figure 9. The effect of dexmedetomidine (D) on HO-1 expression in the kidney of the rats induced by hemorrhagic shock/resuscitation (HS/R). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsHS/R group.

圖9右美托咪定對各組大鼠腎組織HO-1表達(dá)的影響

Figure 10. HE staining of kidney tissues from each group (×200).

圖10HE染色觀察右美托咪定對各組大鼠腎組織病理學(xué)改變

討 論

創(chuàng)傷導(dǎo)致的失血性休克是患者死亡的主要原因。失血性休克及其復(fù)蘇容易導(dǎo)致重要器官缺血再灌注損傷，腎臟是其損傷的靶器官之一[5]。本實驗參照以往的研究建立失血性休克及復(fù)蘇模型[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可減輕腎臟炎性反應(yīng)及氧化反應(yīng)，改善血流動力學(xué)的變化及腎功能。病理檢查結(jié)果也顯示腎損傷明顯減輕。我們在實驗中也證實，右美托咪定可治療明顯增加HO-1的表達(dá)，抑制NF-κB的表達(dá)。以上研究表明，右美托咪定可減輕HS/R誘導(dǎo)的AKI， HO-1及NF-κB可能參與了這一病理生理進(jìn)程。

HS/R誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，正常情況下對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，如果產(chǎn)生過多或清除減少，那么過量產(chǎn)生的氧自由基將導(dǎo)致器官損害。一些研究表明，HS/R誘導(dǎo)了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而抗氧化治療減輕器官損害[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抗氧化作用減輕不同致病因素導(dǎo)致的肝、肺和腎損傷[8-9]。MDA作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，它的濃度反映了組織和細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度；SOD能夠清除過氧化產(chǎn)物，氧自由基等減輕組織器官的損害。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DEX治療減少HS/R誘導(dǎo)的腎組織MDA濃度，增加SOD活性，表明右美托咪定可通過減輕HS/R誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)而減輕腎損傷。HO-1是催化血紅素的限速酶，廣泛存在于各種細(xì)胞，也是一種抗氧化酶。最近研究表明，HO-1通過其抗炎和抗氧化作用在減輕急性腎損傷中發(fā)揮重要作用[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HO-1的表達(dá)減輕HS/R誘導(dǎo)的腎損傷[11]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過上調(diào)HO-1的表達(dá)減輕肺組織炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。有研究表明，HS/R本身會明顯誘導(dǎo)腎組織HO-1的表達(dá)，是機(jī)體的一種保護(hù)反應(yīng)[1, 11]。我們的研究表明，與NS組相比，HS/R誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)升高，而右美托咪定治療進(jìn)一步增加HO-1的表達(dá)，提示HO-1可能參與了DEX抑制HS/R誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)這一病理過程。HO-1正常情況下表達(dá)很低，主要受核因子E2相關(guān)的因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)的調(diào)控。Nrf-2是氧化應(yīng)激的受體，位于各種抗氧化酶的上游，在氧化應(yīng)激刺激下，Nrf-2能介導(dǎo)HO-1的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化作用[13]。研究表明，SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶的活性也受HO-1的調(diào)控，抑制HO-1的活性后，SOD、GSH-Px和CAT表達(dá)減少[ 14]，提示Nrf-2/HO-1/SOD通路可能是抗氧化的重要機(jī)制。本實驗中右美托咪定的抗氧化作用是否與這一通路有關(guān)，仍須作進(jìn)一步的研究。

HS/R誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)也導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的聚集和激活，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β等。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β等炎性細(xì)胞因子誘發(fā)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致腎損傷的重要機(jī)制之一，降低TNF-α和IL-1β的濃度可減輕HS/R誘導(dǎo)的器官損傷[2, 9]。在我們的研究中，HS/R組腎組織TNF-α和IL-1β明顯升高，而右美托咪定治療減輕TNF-α和IL-1β的濃度，表明右美托咪定可通過減輕HS/R誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)而減輕腎損傷。NF-κB是調(diào)控TNF-α在內(nèi)的諸多促炎分子基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)，HS/R后氧化應(yīng)激反應(yīng)能激活NF-κB，從而在休克期間誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[17]。研究表明，右美托咪定可通過抑制NF-κB的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而對腎臟具有保護(hù)作用[18]。我們的研究中，右美托咪定治療抑制HS/R誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)增加，提示右美托咪減輕HS/R誘導(dǎo)炎性反應(yīng)可能與抑制NF-κB的表達(dá)有關(guān)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，抑制HO-1的活性能增加NF-κB的表達(dá)，提示HO-1可通過抑制NF-κB的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[19]。本實驗中，我們并沒有研究右美托咪定的抗炎作用是否與HO-1/NF-κB的表達(dá)有關(guān)。因此，須進(jìn)一步做相關(guān)實驗來進(jìn)行論證。

本實驗中，我們觀察到，失血性休克復(fù)蘇后，血壓逐步下降，而右美托咪定治療能夠減輕血壓下降的程度，提示右美托咪定對AKI的作用可能與提升MAP有關(guān)。HS/R導(dǎo)致缺血再灌注損傷，激活中性粒細(xì)胞釋放活性氧，誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，損害血管內(nèi)皮細(xì)胞。NO是最重要的活性氮物資，NO 可與超氧化物迅速反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(ONOOˉ)及過(氧化)亞硝酸鹽，啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，最終損害肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮肺泡緊密連接，使其通透性增加。研究表明，NO可直接或間接抑制心臟，也可使血管張力降低，導(dǎo)致低血壓[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，出血性休克/復(fù)蘇及隨后的內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致血液中NO增加，而DEX治療能降低NO濃度。最近的研究發(fā)現(xiàn)，通過HO-1產(chǎn)生的一氧化碳(CO)對HS/R誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮有保護(hù)作用[21]。因此，右美托咪定提升血壓的作用可能與抑制炎癥介質(zhì)，減輕氧化反應(yīng)有關(guān)。

總之，右美托咪定通過抗炎及抗氧化作用減輕HS/R誘導(dǎo)的AKI，HO-1的表達(dá)增加及NF-κB的表達(dá)抑制可能參與了這一病理生理進(jìn)程。

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