miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

徐 楊， 趙麗君， 王 春

(濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 山東 濟(jì)南 250022)

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命。資料顯示，世界上每年有13萬(wàn)宮頸癌新增病例，其發(fā)病率和死亡率約占所有女性惡性腫瘤的9%和8%，僅次于乳腺癌[1]。目前宮頸癌的治療方案有早期根治性子宮切除和晚期局部放射治療，但是對(duì)于晚期宮頸癌的治療效果仍不理想[2-3]。研究表明50%的晚期宮頸癌患者對(duì)放射治療不敏感，導(dǎo)致預(yù)后不良，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。因此，放療抵抗是晚期宮頸癌治療失敗的主要原因之一，目前放療敏感性降低的機(jī)制仍不清楚。

微小RNA(microRNAs，miRNAs，miR)是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～22個(gè)堿基對(duì)組成的非編碼RNA，大量研究證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有抑癌(miR-15a、miR-29和miR-214)[5-7]或促癌(miR-21、miR-10b和miR-221)[8-9]功能。研究表明，miRNAs的異常表達(dá)能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性[10-11]。miR-181a通過(guò)靶向抑制促凋亡基因PRKCD的表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射抵抗效應(yīng)[12]。早期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在多種腫瘤組織中低表達(dá)，是一個(gè)腫瘤抑制miRNA；研究發(fā)現(xiàn)miR-145在宮頸癌組織中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[13-14]；最新研究發(fā)現(xiàn)輻射抗性的T細(xì)胞淋巴中miR-145表達(dá)水平顯著低于正常細(xì)胞[15]，提示miR-145表達(dá)與腫瘤細(xì)胞輻射敏感性有關(guān)。miR-145能否調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性，目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究運(yùn)用宮頸癌細(xì)胞系C33A、HeLa、SiHa和CaSki為研究對(duì)象，比較miR-145在宮頸癌細(xì)胞和正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells, ESC)中的表達(dá)水平，觀察miR-145過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞對(duì)輻射敏感性，初步探討miR-145調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制，為以miR-145為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)宮頸癌輻射增敏劑提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系與試劑

宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa購(gòu)自ATCC；ESC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)和雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、MTT和DMSO購(gòu)自Sigma；miR-145模擬劑(miR-145-mimic)和陰性對(duì)照模擬劑(NC-mimic)購(gòu)自廣州銳博生物科技技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京博泰生物技術(shù)有限公司；microRNA提取試劑盒和Taqman miRNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；抗解螺旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子(helicase-like transcription factor，HLTF)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗磷酸化H2AX蛋白(γH2AX)抗體和抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam；BCA試劑盒購(gòu)自Thermo；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中(含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2miR-145表達(dá)水平的檢測(cè) 收集正常培養(yǎng)的HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞，按照mir Vana miRNA分離試劑盒提取各細(xì)胞miRNA，運(yùn)用Taqman miRNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-145的表達(dá)水平；運(yùn)用Trizol提取mRNA，采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，miR-145結(jié)果經(jīng)U6 snRNA內(nèi)參校正，HLTF結(jié)果經(jīng)β-actin校正，miR-145和HLTF mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后以細(xì)胞密度為每孔2.0×104個(gè)接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將miR-145-mimic和NC-mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培養(yǎng)4 h后換成DMEM完全培養(yǎng)基；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4電離輻射及MTT實(shí)驗(yàn) 按照X-射線生物輻照儀說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行操作，輻射劑量率為0.5 Gy/min，運(yùn)用0.5 mm鋁過(guò)濾器對(duì)X射線進(jìn)行過(guò)濾；將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)5 Gy電離輻射照射后，分別于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，以未輻照細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率：細(xì)胞活力抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射，培養(yǎng)72 h后按照Annexin-V/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，細(xì)胞用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，加入200 μL PBS制成細(xì)胞懸液；先加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin-V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育10 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.6免疫熒光觀察 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射，分別于0 h、1 h和6 h進(jìn)行免疫熒光；經(jīng)細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定室溫固定15 min，PBS洗滌后經(jīng)0.1% Triton X-100透化10 min，2% BSA封閉，孵育 I 抗γH2AX(1∶100)、II 抗AF488及DAPI核染色，共聚焦顯微鏡拍照。

2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)重懸細(xì)胞，超聲破碎、12 000 r/min，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵育 I 抗HLTF(1∶1 000)，以β-actin為內(nèi)參照，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次、孵育 II 抗(HRP標(biāo)記)，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影，蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)β-actin校正后用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-145在宮勁癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果示，miR-145在HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著低于ESC(P<0.01)。當(dāng)4株宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145-mimic 48 h后miR-145表達(dá)水平顯著升高，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression level of miR-145 in the cervical cancer cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsESC;##P<0.01vsNC-mimic group.

圖1Real-timePCR檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中miR-145的表達(dá)水平

2 miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

MTT結(jié)果示，NC-mimic和miR-145-mimic轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性均逐漸降低。NC-mimic細(xì)胞經(jīng)電離輻射后，培養(yǎng)48 h的細(xì)胞活性與未輻照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-145-mimic轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后24 h之后細(xì)胞活性顯著低于未輻照組細(xì)胞(P<0.05)；同時(shí)，與NC-mimic細(xì)胞比較，電離輻射照射后相同條件下，miR-145過(guò)表達(dá)細(xì)胞活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。這說(shuō)明miR-145過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。

3 miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示，電離輻射誘導(dǎo)NC-mimic和miR-145-mimic轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞凋亡，相同條件下，miR-145過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞凋亡率顯著增高，與NC-mimic細(xì)胞比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。這一結(jié)果說(shuō)明miR-145過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。

Figure 2. The effects of miR-145 over-expression on the radiosensitivity of cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h;##P<0.01vsNC-mimic group.

圖2miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

Figure 3. The effects of miR-45 over-expression on the apoptosis of the cervical cancer cells induced by ionizing radiation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-mimic group.

圖3miR-45過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

4 miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

免疫熒光觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后1 h和6 h，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)水平顯著增加，提示電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA損傷，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，γH2AX水平逐漸降低，提示部分DSB被修復(fù)；相同條件下，miR-145過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX的熒光強(qiáng)度顯著高于NC-mimic細(xì)胞，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-145過(guò)表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷，增強(qiáng)細(xì)胞輻射敏感性，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The effect of miR-145 over-expression on repair of DNA damage induced by ionizing radiation (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-mimic group.

圖4miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的影響

5 miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)HLTF表達(dá)水平的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，HLTF的mRNA在4種宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HLTF蛋白水平在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)；而miR-145過(guò)表達(dá)顯著抑制HLTF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，見(jiàn)圖5。HLTF高表達(dá)與宮頸癌放療敏感性相關(guān)，HLTF通過(guò)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)誘導(dǎo)宮頸癌的放療抵抗。本研究結(jié)果提示miR-145可能通過(guò)抑制HLTF的表達(dá)抑制DNA損傷修復(fù)，從而增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。

Figure 5. The effects of miR-145 over-expression on the expression of HLTF at mRNA (A) and protein (B) levels in the cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-mimic group.

圖5miR-145過(guò)表達(dá)對(duì)HLTFmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

目前，根治性手術(shù)切除是早期宮頸癌的主要治療方案，對(duì)于晚期和化療耐受的患者首選放射治療，放療作為傳統(tǒng)的治療手段，能夠消滅周亞臨床病灶，在控制復(fù)發(fā)率和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。但是，放射治療對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性宮頸癌的治療效果并不理想，5年生存率僅為20%～50%；資料顯示，大多數(shù)晚期宮頸癌患者對(duì)放療產(chǎn)生抵抗導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16-17]。因此尋找和研發(fā)宮頸癌放療增敏劑迫在眉睫。

miRNA的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)為開(kāi)發(fā)宮頸癌增敏劑的小分子藥物提供了嶄新的思路。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及衰老，其作為腫瘤抑制因子或腫瘤促進(jìn)因子參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-145在多種腫瘤組織如前列腺癌、肝癌、乳腺癌及胃癌中低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-145過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制CDH2、RTKN、HDACs和HIF-2α的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18-22]，認(rèn)為miR-145是一個(gè)腫瘤抑制因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。本研究結(jié)果顯示，miR-145在4株宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞ESC中高表達(dá)，表明miR-145的下調(diào)表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]類(lèi)似。為了進(jìn)一步研究miR-145在宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的作用，我們運(yùn)用miR-145模擬劑實(shí)現(xiàn)miR-145在4株宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-145過(guò)表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，輻射照射后，miR-145過(guò)表達(dá)明顯抑制細(xì)胞活性以及增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率，表明miR-145過(guò)表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)致癌模型的腫瘤組織以及輻射誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中，miR-145的表達(dá)水平出現(xiàn)異常，提示miR-145的異常表達(dá)與電離輻射后細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

目前，宮頸癌放療抵抗的分子機(jī)制仍不清楚。以往研究發(fā)現(xiàn)，外界應(yīng)激如紫外線、電離輻射，活性氧自由基等刺激細(xì)胞引起DNA損傷時(shí)，p53表達(dá)增高，通過(guò)激活下游靶基因p21的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑被清除。近期研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷激活p53表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤抑制型miRNA的轉(zhuǎn)錄如miR-16-1、miR-143和miR-145[14]。γH2AX是DNA雙鏈斷裂(DSB)的標(biāo)志物，電離輻射殺死腫瘤細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA斷裂，引起無(wú)法修復(fù)的DNA損傷最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[23]。本研究結(jié)果顯示，miR-145過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，提示miR-145過(guò)表達(dá)DNA損傷加劇或DNA損傷修復(fù)功能被抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示miR-145過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示miR-145過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中發(fā)生DNA損傷的積累，機(jī)體為了清除有害的細(xì)胞，部分損傷的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑得以清除。目前關(guān)于miR-145調(diào)控DNA損傷的機(jī)制是不清楚的。有研究表明DNA損傷發(fā)生時(shí)，H2AX在DSB位點(diǎn)被一些蛋白激酶如ATM、ATR、DNA-PK等PI3K家族激酶磷酸化(γH2AX)，形成肉眼可見(jiàn)的熒光焦點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示miR-145過(guò)表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的γH2AX激活，其機(jī)制是否通過(guò)影響ATM、ATR、DNA-PK等的激酶活性進(jìn)而影響γH2AX的水平，需要進(jìn)一步研究。此外，有研究證實(shí)HLTF具有促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的功能，HLTF過(guò)表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射抗性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-145過(guò)表達(dá)顯著抑制HLTF的轉(zhuǎn)錄和和翻譯，HLTF mRNA和蛋白水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，提示miR-145通過(guò)抑制HLTF的表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌的放療敏感性，但miR-145可否直接靶向HLTF還有待進(jìn)一步研究。本研究為以miR-145為靶點(diǎn)研發(fā)宮頸癌小分子放療增敏劑提供了理論依據(jù)。

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