骨髓基質(zhì)細胞介導(dǎo)的微環(huán)境對人肺腺癌A549細胞的作用*

李 汪， 陳思成， 孫艷婷， 李具瓊， 朱 穎， 張盟浩， 陳 彬， 施 瓊△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床診斷教育部重點實驗室， 重慶 400016； 2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在男性和女性所患腫瘤均居首位，死亡率在男性各腫瘤中居首，女性中居次[1]。盡管最近幾年肺癌的5年生存率略有增長，但是肺癌的預(yù)后仍不樂觀[2]。而肺癌預(yù)后較差的一大原因即是其容易轉(zhuǎn)移，因此控制肺癌轉(zhuǎn)移是改善病人預(yù)后的重要課題。1989年，Paget等[3]關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的“土壤和種子”理論是腫瘤研究史上的里程碑事件。轉(zhuǎn)移靶器官的微環(huán)境決定了轉(zhuǎn)移灶是否能形成，而骨髓基質(zhì)細胞構(gòu)成了腫瘤骨轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境。骨髓基質(zhì)細胞也就是間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)[4]，是腫瘤基質(zhì)中的重要組成成分，能通過分泌多種組分來影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

趨化因子是由白細胞或一些基質(zhì)細胞分泌的能結(jié)合于內(nèi)皮表面的對某些免疫細胞(如中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)具有趨化和激活作用的一類細胞因子，通過與其特定的受體結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5]，腫瘤炎癥微環(huán)境中的重要組成成分。趨化因子受體根據(jù)其N端半胱氨酸殘基(cysteine，Cys)的數(shù)目和相對位置不同可以分為CXC、CC、C和CX3C共4個亞類[6]。而CX3C趨化因子受體1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)是CX3CR家族中目前已知的唯一成員。目前的研究已經(jīng)證實，該受體能夠參與調(diào)控骨肉瘤、腎癌和肺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-9]，其既能參與腫瘤細胞的黏附趨化，又能參與抗腫瘤免疫，在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。MSCs對腫瘤的作用具有雙面性，既可促進又可抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[10-11]，但對肺腺癌細胞的作用尚未完全闡明。本課題采用人骨髓基質(zhì)細胞HS-5為研究對象，利用HS-5細胞條件培養(yǎng)基(HS-5 cell-conditioned medium，HS-5-CM)處理人肺腺癌A549細胞，旨在探討MSCs對肺腺癌細胞的作用和機制，以及該過程中CX3CR1的變化，為肺癌的臨床治療提供一些新的治療策略。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 人肺腺癌細胞株A549和人骨髓基質(zhì)細胞株HS-5由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床診斷檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室前期保存?zhèn)溆谩?種細胞均用含有10%胎牛血清的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2種細胞均貼壁生長，當(dāng)融合度達到80%時，行常規(guī)胰酶消化傳代。

1.2主要試劑 RPMI-1640高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone；qPCR試劑盒和qPCR引物購自TaKaRa；MTT試劑購自Sigma；兔抗人CX3CR1單克隆抗體購自Abcam；兔抗人細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra-cellular signal-regulated kinase，ERK)及磷酸化ERK(phosphorylated ERK，p-ERK)單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗人β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz；Western blot及蛋白提取相關(guān)試劑和MAPK/ERK特異性抑制劑U0126購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore。

2 方法

2.1HS-5-CM的制備 將融合度為70%的HS-5細胞接種在直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，待貼壁后PBS洗3次，更換為10 mL無血清的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基，第1天收集一次上清液；另一培養(yǎng)皿中的上清液留待第2天收集，之后1 000 r/min離心15 min，取上清分別標記為HS-5-CM-24 h和HS-5-CM-48 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2MTT法檢測HS-5-CM對A549細胞活力的影響 A549細胞以每孔500 個接種于96孔板中，每組4個平行孔，待細胞貼壁后PBS洗3次，加入無血清培養(yǎng)液100 μL。實驗分為空白對照(blank control，blank)組：A539細胞；HS-5-CM-24 h組：A549細胞+HS-5-CM-24 h；HS-5-CM-48 h組：A549細胞+HS-5-CM-48 h。分別于第1、2和3 d對A549細胞進行MTT檢測，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，輕搖振蕩15 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度(A)，重復(fù)3次取平均值。

2.3劃痕實驗檢測HS-5-CM對A549細胞遷移能力的影響 A549細胞以2×105的密度接種于6孔板中，細胞密度達到90%時，用10 μL小槍頭行“一”字劃痕，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，每孔加入含2%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，此時記為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在同一觀察點觀察劃痕愈合情況并拍照，通過計算多個觀察點劃痕寬度平均值，得出各組細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復(fù)3次。

2.4qPCR檢測A549細胞中CX3CR1 的mRNA表達 Trizol法提取各組A549細胞總RNA，按試劑盒的方法逆轉(zhuǎn)錄，以轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行PCR擴增。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 30 s。重復(fù)實驗3次。反應(yīng)引物序列如下：CX3CR1的上游引物序列為5′-CAACAGCAAGAAGCCCAAGAG-3′，下游引物序列為5′-TGAAGAAGAAGGCGGTAGTGAA-3′；β-actin的上游引物序列為5′-CCACCGAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。

2.5Western blot 檢測蛋白水平 用MAPK/ERK信號通路抑制劑U0126處理A549細胞24 h后，再加HS-5-CM處理24 h，饑餓處理后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，煮沸10 min至蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入 II 抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯影。Quantity One軟件計算各電泳條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照，得出各蛋白的表達水平，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗比較兩組間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性，多組數(shù)據(jù)差異的比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HS-5-CM能促進A549細胞的活力

MTT結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)第1和2天時HS-5-CM-24 h組和HS-5-CM-48 h組的A490值較blank組增加不明顯，第3天時HS-5-CM-24 h組和HS-5-CM-48 h組的A490較blank組均顯著增加(P<0.01),見圖1。這說明HS-5-CM可以促進A549細胞的活力。

Figure 1. The effects of HS-5-CM on the viability of A549 cells measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖1MTT測定HS-5-CM對A549細胞活力的影響

2 HS-5-CM能促進A549細胞的遷移能力

劃痕實驗結(jié)果顯示，HS-5-CM-24 h組和HS-5-CM-48 h組的細胞劃痕在24 h的愈合率與blank組比較顯著升高(P<0.01)，見圖2。這說明HS-5-CM明顯促進A549細胞的遷移。

Figure 2. The effects of HS-5-CM on the migration ability of A549 cells measured by wound-healing assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖2HS-5-CM對A549細胞遷移能力的影響

3 HS-5-CM能增加A549細胞中CX3CR1的表達

qPCR結(jié)果顯示，與blank組相比，HS-5-CM-48 h組CX3CR1的mRNA表達明顯上升(P<0.05)。說明HS-5細胞能增加A549細胞中CX3CR1的mRNA表達水平，見圖3。

Figure 3. The mRNA expression of CX3CR1 in the A549 cells after treated with HS-5-CM. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3qPCR測定HS-5-CM對A549細胞中CX3CR1表達的影響

4 HS-5-CM能激活A(yù)549細胞中MAPK/ERK信號通路

Western blot結(jié)果顯示，與blank組相比，HS-5-CM-48 h組的p-ERK/ERK的比值增加(P<0.05)；分別加入5 μmol/L和10 μmol/L的MAPK/ERK通路抑制劑U0126處理24 h后，與HS-5-CM-48h組相比，5 μmol/L抑制劑組和10 μmol/L抑制劑組的p-ERK/ERK的比值均減少(P<0.01)，見圖4。

5 MAPK/ERK信號通路受抑可以減弱HS-5-CM促A549細胞遷移的作用

劃痕實驗結(jié)果顯示，與blank組相比，HS-5-CM-48 h組的A549細胞劃痕在24 h的愈合率顯著升高(P<0.01)；分別加入5 μmol/L和10 μmol/L的MAPK/ERK通路抑制劑U0126處理24 h后，與HS-5-CM-48 h組相比，5 μmol/L抑制劑組和10 μmol/L抑制劑組的細胞劃痕愈合率均顯著下降(P<0.01)，說明MAPK/ERK信號通路受抑制可以減弱HS-5-CM促A549細胞遷移的作用，見圖5。

6 抑制MAPK/ERK信號通路可以降低HS-5-CM處理后A549細胞中CX3CR1的表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，與blank 組相比，HS-5-CM-48 h組A549細胞的CX3CR1蛋白表達上升(P<0.05)；分別加入5 μmol/L和10 μmol/L的MAPK/ERK通路抑制劑U0126處理24 h后，與HS-5-CM-48 h組相比， 5 μmol/L抑制劑組和10 μmol/L抑制劑組細胞的CX3CR1蛋白表達均顯著下降(P<0.05)，說明抑制MAPK/ERK信號通路可以降低HS-5-CM處理后A549細胞中CX3CR1的表達，見圖6。

Figure 4. The protein levels of p-ERK in the A549 cells treated with MAPK/ERK inhibitor U0126 after exposed to HS-5-CM for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;##P<0.01vsHS-5-CM-48 h group.

圖4MAPK/ERK抑制劑對HS-5-CM處理后A549細胞內(nèi)p-ERK蛋白水平的影響

討 論

肺癌作為一種最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，由于其發(fā)病隱匿，很多患者初診時就已發(fā)現(xiàn)了遠處轉(zhuǎn)移。一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率不足5%，是導(dǎo)致患者治療療效差和死亡率高的重要原因，所以探索和闡明肺癌轉(zhuǎn)移的具體機制十分迫切。

目前，隨著對腫瘤研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到特定的器官，是與該器官的微環(huán)境密切相關(guān)的。而維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)需要成骨細胞、破骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞等共同參與。目前研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過分泌多種細胞因子來促進或者抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[12-15]。本研究所采用的骨髓基質(zhì)細胞HS-5是人永生化的細胞，解決了原代細胞提取困難、傳代代數(shù)少的問題。同時本研究通過骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基處理肺腺癌A549細胞，MTT實驗發(fā)現(xiàn)HS-5條件培養(yǎng)基能促進A549細胞的活力，劃痕愈合實驗證實其能上調(diào)A549細胞的遷移能力，同時，在A549細胞活力和遷移能力上調(diào)的過程中，MAPK/ERK信號通路會活化，p-ERK蛋白水平升高。MAPK/ERK信號通路主要參與細胞的活力和分化，該通路異常激活可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。使用MAPK/ERK信號通路抑制劑U0126之后，骨髓基質(zhì)細胞對A549細胞的這種促遷移能力會有所下調(diào)，p-ERK蛋白水平下調(diào)，劃痕愈合能力降低。說明MAPK/ERK信號通路參與了骨髓基質(zhì)細胞調(diào)控A549細胞遷移的過程。

Figure 5. The migration ability of A549 cells treated with MAPK/ERK pathway inhibitor U0126 after exposed to HS-5-CM for 48 h (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsHS-5-CM-48 h group.

圖5MAPK/ERK信號通路受抑對HS-5-CM促A549細胞遷移能力的影響

Figure 6. The protein expression of CX3CR1 in the A549 cells treated with MAPK/ERK inhibitor U0126 after exposed to HS-5-CM for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.015vsHS-5-CM-48 h group.

圖6MAPK/ERK通路抑制劑對A549中CX3CR1表達的影響

另外，CX3CR1是一種多功能的趨化因子受體，已被證實能參與調(diào)控多種腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)。但MSCs介導(dǎo)的CX3CR1是否在骨微環(huán)境中影響肺癌的發(fā)生發(fā)展目前還不清楚。本研究證實，在骨髓基質(zhì)細胞促進A549細胞遷移的過程中，CX3CR1的表達有所上升，在使用MAPK/ERK通路抑制劑影響骨髓基質(zhì)細胞對A549細胞的作用后，CX3CR1的表達下調(diào)，說明，CX3CR1可能參與骨髓基質(zhì)細胞對A549細胞的調(diào)控過程，但具體機制有待進一步探討。

綜上所述，本研究說明了HS-5細胞可以促進A549細胞的增殖和遷移，其機制可能涉及MAPK/ERK通路的活化和CX3CR1的表達變化。這可為我們進一步研究趨化因子受體在腫瘤微環(huán)境中的作用提供方向，同時為臨床肺癌治療和預(yù)后判斷提供一些幫助。

致謝：衷心感謝分子腫瘤學(xué)實驗室何通川老師、翁亞光老師、張彥老師、羅進勇老師、唐敏老師、左國偉老師等在實驗過程中給予的指導(dǎo)幫助，感謝郭楊柳師兄、李亞師兄、范夢恬師姐等給予我悉心的疑難指導(dǎo)。

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