PGRN基因沉默對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及遷移的影響*

孫艷婷， 陳思成， 李 汪， 李具瓊， 朱 穎， 施 瓊△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院， 臨床診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016； 2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

肺癌是近年來最常見的惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)組織學(xué)和病理學(xué)分型可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的85%，是最常見的肺癌類型。非小細(xì)胞肺癌的病理分型包括肺腺癌、 肺鱗癌和大細(xì)胞肺癌[2]。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明約有26%的腫瘤患者因肺癌死亡[3]，肺癌死亡率在我國一直居高不下，其治療效果有限。因此，探討非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尤為重要，并有可能為臨床提供新的治療策略。

顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)屬于生長因子家族中的分泌型糖蛋白[4]，在損傷修復(fù)[4]、急性肺損傷/成人呼吸窘迫綜合征[5]、骨關(guān)節(jié)炎[6]和腫瘤發(fā)展進(jìn)程[7]中發(fā)揮著重要作用。據(jù)研究報道，PGRN可以促進(jìn)乳腺癌[8]、肝癌[9]、膀胱癌[7]和結(jié)直腸癌[10]等多種腫瘤的發(fā)生，而目前的報道中尚未有關(guān)于PGRN在非小細(xì)胞肺癌中的作用及機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)采用高表達(dá)PGRN的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549為研究對象，通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)特異性干擾PGRN基因的表達(dá)，以研究PGRN基因沉默對A549細(xì)胞增殖及遷移的影響，并初步探討其分子機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株與試劑

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549以及人正常支氣管上皮(human bronchial epithelial，HBE)細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)教育部臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone；澳洲胎牛血清購自Gibco; TRIzol和Lipofectamine 2000均購自Invitrogen；特異性干擾PGRN基因的小干擾RNA(PGRN-small interfering RNA, PGRN-siRNA)和無意義小干擾RNA(scrambled siRNA, sc-siRNA)均購自上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑和qPCR反應(yīng)相關(guān)試劑均購自TaKaRa; qPCR引物由上海百力格公司合成；Transwell小室購自Corning；1%結(jié)晶紫染液、MTT以及臺盼藍(lán)試劑均購自Sigma；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和Western blot檢測相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore；羊抗人PGRN 抗體購自R & D Systems； 鼠抗人Bcl-2、Bax和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體及兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體購自Santa Cruz；兔抗人細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2, p-ERK1/2)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)抗體購自CST；抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊、羊抗兔和羊抗鼠IgG(II 抗)購自北京中杉金橋生物公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，在37 ℃、5% CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)滿視野后，用0.25%的胰蛋白酶消化后離心，并用新鮮培養(yǎng)液重懸、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25%的胰酶消化、離心、重懸，并以每孔2×105的密度鋪于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時,將PGRN-siRNA和sc-siRNA分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24～48 h后，提取細(xì)胞總RNA，用于后續(xù)qPCR檢測；轉(zhuǎn)染48～72 h后，提取細(xì)胞總蛋白，用于后續(xù)的Western blot檢測。sc-siRNA的模板鏈序列為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；PGRN-siRNA的模板鏈序列為 5’-GCUUCCAAAGAUCAGGUAATT-3’，反義鏈序列為 5’-UUACCUGAUCUUUGGAAGCTT-3’。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分3組 ：(1)空白對照(control)組，即未轉(zhuǎn)染任何siRNA的A549細(xì)胞；(2)sc-siRNA組，即轉(zhuǎn)染了sc-siRNA 的A549細(xì)胞；(3)PGRN-siRNA組，即轉(zhuǎn)染了PGRN-siRNA的A549細(xì)胞。

2.3qPCR法檢測細(xì)胞中PGRN的mRNA 表達(dá) TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參照，檢測各組細(xì)胞中PGRN mRNA的表達(dá)水平。PGRN的上游引物序列為 5’-AGCAGGGAGGAGAGTGATTT-3’，下游引物序列為 5’-GGGTAGCGCTCAGACTACAG-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為 5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’，下游引物序列為 5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’。PCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性10 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blot法檢測PGRN以及增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白的上樣量均為250 μg，計算出蛋白上樣體積。SDS-PAGE分離目的蛋白，恒流(210 mA)電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% BSA封閉2 h，加入羊抗人PGRN，鼠抗人Bcl-2、Bax和cyclin D1，兔抗人PCNA、 ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt單克隆抗體(稀釋比例為 1∶1 000)，4 ℃過夜； TBST洗膜后室溫孵育相應(yīng)的 II 抗(稀釋比例為1∶5 000)，TBST 洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影。采用 Quantity One軟件分析條帶的灰度值，用目的條帶與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比表示蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5MTT法檢測細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染48 h后消化、離心并重懸細(xì)胞，將 2 000個細(xì)胞鋪于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48和60 h后在相應(yīng)的時點(diǎn)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL MTT，4 h后用酶標(biāo)儀在492 nm 波長處檢測各孔的吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6活細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞融合 90% 時，用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后重懸，將0.4% 臺盼藍(lán)染液按1∶1比例加入細(xì)胞懸液中。用牛鮑計數(shù)板充池后在顯微鏡下計數(shù)，并算出活細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞融合 90% 時，用PBS輕柔沖洗3次，加入400 μL甲醛，室溫放置20 min，棄去甲醛并用PBS沖洗3次，加入400 μL結(jié)晶紫溶液，染色20 min后，再用PBS沖洗3次，于通風(fēng)處風(fēng)干，并在顯微鏡下拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞融合 90% 時， 用 10 μL小槍頭行“十”字劃線 ； PBS沖洗3次后換新鮮培養(yǎng)液，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；此后在顯微鏡下分別于0 h和48 h于同一位點(diǎn)拍照。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將處理24 h后的各組細(xì)胞消化、離心后用普通DMEM培養(yǎng)液(不含血清)重懸，在24孔板的下室中加入700 μL 含 10% 胎牛血清的完全 DMEM培養(yǎng)基，上室加入400 μL含有10 000個細(xì)胞的懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。24 h后取出，清洗小室，固定并染色。顯微鏡下計數(shù)，至少觀察10個視野，計數(shù)后取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0和GraphPad軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PGRN在A549細(xì)胞中的表達(dá)高于正常支氣管上皮細(xì)胞

qPCR結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中PGRN的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常支氣管上皮細(xì)胞(P<0.01)，見圖1A；Western blot結(jié)果顯示，A549細(xì)胞中PGRN的蛋白表達(dá)水平較HBE細(xì)胞明顯升高(P<0.01)，見圖1B。這一結(jié)果表明，PGRN有可能是促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。

2 PGRN-siRNA抑制A549細(xì)胞中PGRN mRNA 和蛋白的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，PGRN-siRNA組中PGRN的mRNA表達(dá)水平均較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P<0.01)，見圖2A；Western blot結(jié)果顯示，PGRN-siRNA組A549細(xì)胞中PGRN蛋白的表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組相比顯著降低(P<0.01)，見圖2B。這一結(jié)果表明，PGRN-siRNA轉(zhuǎn)染能有效干擾A549細(xì)胞中PGRN的mRNA和蛋白表達(dá)。

3 PGRN 表達(dá)下調(diào)可抑制A549細(xì)胞的活力和增殖能力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0 h時各處理組細(xì)胞的A值無明顯差異；而24 h、48 h和60 h時，PGRN-siRNA組A549細(xì)胞中的A值比空白對照和陰性對照組均明顯降低(P<0.01)，見圖3A?；罴?xì)胞計數(shù)和結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，PGRN-siRNA組A549細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)比空白對照和陰性對照組均顯著降低(P<0.01)，見圖3B、C。這一結(jié)果說明干擾PGRN基因可以抑制A549細(xì)胞的活力和增殖能力。

Figure 1. The expression levels of PGRN in the A549 cells and HBE cells. A: the mRNA expression of PGRN was detected by qPCR； B: the protein expression was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHBE group.

圖1HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞中PGRN的mRNA和蛋白表達(dá)水平

Figure 2. Transfection with PGRN-siRNA decreased PGRN expression in the A549 cells. A: the mRNA expression of PGRN was detected by qPCR； B: the protein expression was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGRN-siRNA后PGRN的mRNA和蛋白表達(dá)水平

4 PGRN表達(dá)下調(diào)可抑制A549細(xì)胞的遷移

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組48 h的劃痕愈合率與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而PGRN-siRNA組與陰性對照組相比其劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)，見圖4A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PGRN-siRNA組中A549細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，見圖4B。以上結(jié)果說明干擾PGRN基因可以明顯抑制A549細(xì)胞的遷移能力。

5 PGRN 表達(dá)下調(diào)影響增殖相關(guān)蛋白PCNA和cyclin D1 以及凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2和Bax的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PGRN-siRNA 48 h后PGRN-siRNA組中PCNA、cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組相比明顯減少(P<0.01)，而Bax的蛋白表達(dá)水平較空白對照組和陰性對照組明顯升高(P<0.01)，見圖5A。這提示轉(zhuǎn)染PGRN-siRNA特異性干擾PGRN表達(dá)后，可以抑制A549細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

6 PGRN 表達(dá)下調(diào)對PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，將PGRN-siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中48 h后PGRN-siRNA組中p-ERK1/2和p-Akt較陰性對照組和空白對照組均明顯降低(P<0.01)，見圖5B。以上結(jié)果說明PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路可能參與PGRN調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的過程。

Figure 3. The effect of PGRN-siRNA on the viability and proliferation ability of the A549 cells. A: the cell viability was measured by MTT assay； B and C： the proliferation ability was detected by living cell counting and crystal violet staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3干擾PGRN基因?qū)549細(xì)胞活力和增殖的影響

Figure 4. The migration ability was detected by wound-healing (A) and Transwell (B) assays in the A549 cells transfected with PGRN-siRNA or sc-siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4干擾PGRN基因?qū)549細(xì)胞遷移能力的影響

討 論

肺癌在我國的發(fā)病率近年來呈逐年上升的趨勢，其死亡率也在逐年增加。肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程。目前臨床上針對非小細(xì)胞肺癌的常用治療手段為手術(shù)治療輔助以放化療，近年來小分子靶向藥物治療也廣泛應(yīng)用于臨床。但是由于非小細(xì)胞肺癌具有隱匿性的特點(diǎn)，發(fā)病初期癥狀不明顯，很多患者確診時已是病程晚期，耽誤了最佳治療時期，使得治療效果不佳[11]。隨著人們對非小細(xì)胞肺癌研究的不斷深入，生長因子家族在其發(fā)生發(fā)展中的作用被廣泛認(rèn)知。血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)[12]、表皮生長因子[13]和轉(zhuǎn)化生長因子[14]等均在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)PGRN也屬于生長因子家族中的一員[4]，它被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，如在肝癌中可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]，在乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌[10,16-17]中也有報道。研究發(fā)現(xiàn)這種促腫瘤效應(yīng)可能與p44/42 MAPK和Akt信號通路的激活有關(guān)[6]，但是具體作用機(jī)制不明。而PGRN在非小細(xì)胞肺癌中的作用以及具體作用機(jī)制也尚未見報道。

Figure 5. The effect of PGRN-siRNA on proliferation- and apoptosis-related factors and the protein levels of p-ERK1/2 and p-Akt in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5干擾PGRN基因?qū)549細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白以及磷酸化ERK1/2和磷酸化Akt的蛋白表達(dá)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常支氣管上皮細(xì)胞株相比，PGRN的mRNA和蛋白水平在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中有明顯的高表達(dá)，推測PGRN可能會參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展?；诖吮狙芯坎捎眯「蓴_RNA特異性干擾A549細(xì)胞株中PGRN的表達(dá)，MTT實(shí)驗(yàn)檢測到干擾PGRN后A549細(xì)胞株的活力顯著降低；活細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾PGRN后A549細(xì)胞株的增殖能力顯著降低；而且，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明干擾PGRN后A549細(xì)胞株的遷移能力顯著降低；Western blot結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞株中特異性干擾PGRN的表達(dá)后，PCNA和cyclinD1的表達(dá)明顯下降，在凋亡相關(guān)蛋白中，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著增加且抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低。本實(shí)驗(yàn)表明，PGRN確實(shí)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PGRN基因沉默后，A549細(xì)胞株中p-Akt和p-ERK1/2蛋白水平明顯降低。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明 PI3K/Akt和MAPK/ERK 信號通路可能與PGRN調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的過程有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGRN基因沉默能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的增殖和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這一作用機(jī)制可能與PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的阻斷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供了一個新的潛在靶點(diǎn)。但是PGRN的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究探討。

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