GSE74602芯片數(shù)據(jù)中直腸癌關(guān)鍵基因與治療藥物的生物信息學(xué)篩選

羅磊，龔寶成，劉福囝

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸腫瘤外科，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

結(jié)直腸癌是世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第三[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是由多基因和細(xì)胞通路發(fā)生改變共同作用的結(jié)果[2]。當(dāng)今，治療結(jié)直腸癌的主要方式是手術(shù)和系統(tǒng)抗腫瘤治療，目前尚不能精確地從分子機(jī)制方面分析結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，因此了解結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的相關(guān)分子機(jī)制及篩選出潛在的治療結(jié)直腸癌的小分子藥物，對(duì)更有效的診斷結(jié)直腸癌及其治療方案的制定尤為重要。

基因芯片分析提供了關(guān)于腫瘤進(jìn)展中涉及的分子全面而詳細(xì)的變化，從而更好地了解細(xì)胞癌變過(guò)程以及發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[3]。目前仍然缺乏對(duì)臨床有用的癌癥診斷標(biāo)記物，基因芯片分析之所以沒(méi)有在臨床上得到大量的應(yīng)用，主要?dú)w結(jié)于下列幾種原因：缺乏對(duì)比分析對(duì)每個(gè)已經(jīng)獲得的研究結(jié)果重疊度的比較；應(yīng)用平臺(tái)的類型、樣品收集和處理以及數(shù)據(jù)分析的相關(guān)變異性；缺乏大規(guī)模對(duì)有價(jià)值的樣本的分析；缺乏可靠的關(guān)于臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)的理解[4-5]。

為了更加深入的研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，本研究從基因表達(dá)大棚車（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了GSE74602的基因表達(dá)芯片，然后利用R語(yǔ)言的Limma包篩選結(jié)直腸癌患者和正常的結(jié)直腸上皮組織之間的差異表達(dá)基因，并且對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，從而更好的研究與結(jié)直腸癌相關(guān)的分子機(jī)制。另外，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異表達(dá)基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape軟件中的MCODE插件進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析，從而進(jìn)一步發(fā)掘在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中起著核心作用的基因，最后通過(guò)連通圖篩選了前10個(gè)具有潛在治療結(jié)直腸癌的小分子藥物，為以后研究結(jié)直腸癌的分子機(jī)制和靶向藥物提供重要方向以及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

從高通量表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載結(jié)直腸癌的GSE74602基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)芯片數(shù)據(jù)，該芯片是通過(guò)美國(guó)昂飛老鼠基因組芯片平臺(tái)GPL1261進(jìn)行注釋的。GSE74602芯片包括30例結(jié)直腸患者樣本和30例正常結(jié)直腸組織標(biāo)本。

1.2 芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理

在芯片的預(yù)處理階段，利用R語(yǔ)言中的Affy包對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)之間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，去除一些不必要的影響因素。然后根據(jù)芯片平臺(tái)注釋信息將探針名字轉(zhuǎn)換為基因名，對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)1個(gè)基因的問(wèn)題，采用這幾個(gè)探針的平均值來(lái)表示，從而對(duì)應(yīng)到該基因的表達(dá)量。

1.3 篩選差異表達(dá)基因

預(yù)處理芯片之后，利用R語(yǔ)言中的Limma包篩選癌癥和正常組織之間的差異表達(dá)基因，采用t檢驗(yàn)分析癌癥和正常組織之間的表達(dá)，篩選出調(diào)整后P＜0.05，而且|log2FC|＞2的基因作為差異表達(dá)基因。然后對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，并且通過(guò)R語(yǔ)言中的gplots包繪制熱圖。

1.4 基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科（KEGG）信號(hào)通路分析

DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)主要用來(lái)進(jìn)行基因的注釋、功能分類、信號(hào)通路分析以及基因之間編號(hào)的轉(zhuǎn)換[6]。本研究使用的是功能注釋，獲得結(jié)直腸癌相關(guān)的差異表達(dá)基因之后，為了進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，將差異表達(dá)基因上傳到DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）中進(jìn)行GO功能分析和KEGG信號(hào)通路分析，根據(jù)美國(guó)生物技術(shù)信息國(guó)立中心的重要功能分類，可以把GO分為分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）及細(xì)胞組分（cellular component，CC）3部分。最終得到差異表達(dá)基因及所參與的相關(guān)信號(hào)通路[7-8]。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和子網(wǎng)絡(luò)模塊分析

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)主要整合了來(lái)源不同的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，如高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，共表達(dá)數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)等，構(gòu)建一種特殊的根據(jù)基因之間的結(jié)合分?jǐn)?shù)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白間相關(guān)度的體系。本研究中，為了進(jìn)一步探索與結(jié)直腸癌相關(guān)的核心基因以及作用機(jī)制，篩選到的差異表達(dá)基因上傳到STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org）進(jìn)行蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，最終通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白間作用網(wǎng)絡(luò)，從而找出在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中起到核心作用的基因（結(jié)合分?jǐn)?shù)＞0.4）。另外，為了更深入的研究在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中起著更加精細(xì)的調(diào)控作用的核心基因，利用Cytoscape軟件中的MCODE插件進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析，選出MCODE分?jǐn)?shù)＞3且基因數(shù)＞4的子網(wǎng)絡(luò)[9-10]。

1.6 連通圖分析

連通圖（The Connectivity Map，cMap，http://www.broad.mit.edu/cmap）是一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，它是收集來(lái)自用小分子處理的培養(yǎng)的人類細(xì)胞，大約超過(guò)7 000多個(gè)的表達(dá)譜，以前已被應(yīng)用于探索藥物作用的機(jī)制以及確定新的潛在藥物[11]。然后把蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中的差異表達(dá)基因被映射到cMap數(shù)據(jù)庫(kù)上，富集分?jǐn)?shù)范圍從-1到1，并使用富集評(píng)分的絕對(duì)值＞0.7且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

通過(guò)R語(yǔ)言中的Affy包將原始芯片數(shù)據(jù)的系統(tǒng)誤差去除，從而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。通過(guò)R語(yǔ)言中的Limma包對(duì)結(jié)直腸癌組織和正常組織標(biāo)準(zhǔn)化之后的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，最終231個(gè)基因達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05且倍數(shù)變化的絕對(duì)值＞2），其中有122個(gè)上調(diào)基因，109個(gè)下調(diào)基因（圖1）。利用R語(yǔ)言中的pheatmap包繪制差異顯著的前20個(gè)上調(diào)基因和前20下調(diào)基因的熱圖，直觀的顯示出差異表達(dá)基因（圖2）。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖（紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，而黑色代表無(wú)差異表達(dá)基因）Figure 1 The volcano plot of differentially expressed genes (the red dots and green dots standing for the up-regulated genes and down-regulated genes respectively, and the black dots representing genes not differentially expressed)

2.2 差異基因功能和通路途徑分析

為了進(jìn)一步探究差異基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析以及信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要參與細(xì)胞中碳酸氫鹽的運(yùn)輸，一碳代謝途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡等生物學(xué)過(guò)程；并且參與細(xì)胞外液、細(xì)胞間質(zhì)以及細(xì)胞頂端質(zhì)膜的組成；還可以促進(jìn)鈣離子通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶激活（表1）。下調(diào)基因主要參與細(xì)胞核的有絲分裂、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞之間的黏附等生物學(xué)過(guò)程；參與紡錘體、細(xì)胞核以及細(xì)胞液的構(gòu)成；能夠促進(jìn)與蛋白激酶的結(jié)合，活化三磷酸腺苷及激活肽酶（表2）。

圖2 熱圖中的40個(gè)差異表達(dá)基因（包括20個(gè)上調(diào)基因和20個(gè)下調(diào)基因；紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)）Figure 2 Heat map of the top 40 differentially expressed genes(including 20 up-regulated genes and 20 downregulated genes; red color showing the up-regulated gene, and green color showing the down-regulated genes)

通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)：上調(diào)基因主要參與細(xì)胞中礦物質(zhì)的吸收，細(xì)胞中氮的代謝，近端小管對(duì)碳酸氫鹽的重吸收作用，膽汁及胰液的分泌等信號(hào)通路。而下調(diào)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期的形成，p53信號(hào)通路的傳遞等信號(hào)通路（表3）。

表1 上調(diào)基因的GO功能分析Table 1 GO enrichment analysis of the up-regulated genes

表2 下調(diào)基因的GO功能分析Table 2 GO enrichment analysis of the down-regulated genes

表3 差異表基因顯著參與的KEGG信號(hào)通路Table 3 The KEGG pathway signi fi cantly enriched in differentially expressed genes

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及子網(wǎng)絡(luò)模塊分析

為了進(jìn)一步研究差異基因在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)（圖3），總共包含有159個(gè)節(jié)點(diǎn)和606條邊。這里節(jié)點(diǎn)代表的是富集到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)基因，而邊反映的是差異表達(dá)基因之間的相互作用。通過(guò)分析篩選了了前40個(gè)度值＞10的基因（表4）。

另外結(jié)合子網(wǎng)絡(luò)模塊分析，發(fā)現(xiàn)了一些新的在結(jié)直腸癌發(fā)生的局部調(diào)控中起著重要作用的關(guān)鍵基因，如KIF20A、CENPF、NCAPG、PYY、IQGAP3，他們分別位于不同的子網(wǎng)絡(luò)中（圖4），這為以后研究結(jié)直腸癌的分子機(jī)制提供了更多的依據(jù)。

2.4 小分子藥物篩選

基于cMap數(shù)據(jù)庫(kù)映射的結(jié)果，總共篩選了前10個(gè)小分子藥物，例如紫霉素、克洛索隆、納多洛爾等（表5）。

圖3 差異表達(dá)基因中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（總共包含有159個(gè)節(jié)點(diǎn)和606條邊；紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因）Figure 3 Protein-protein interaction networks of the differential expressed genes (containing 159 nodes and 606 edges;red color showing the up-regulated gene, and green color showing the down-regulated genes)

表4 篩選出度值大于10的40個(gè)基因Table 4 Forty screened genes with a degree greater than 10

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的子網(wǎng)絡(luò)分析（包括4個(gè)模塊）Figure 4 Sub-module analysis of the protein-protein interaction networks (including 4 modules)

表5 前10個(gè)具有潛在治療結(jié)直腸癌的小分子藥物Table 5 Top 10 small molecule drugs potentially against colorectal cancer

3 討 論

結(jié)直腸癌作為世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要是由于基因表達(dá)異常而引起各種遺傳和表觀遺傳改變導(dǎo)致的結(jié)果[12]。本研究中，利用生物信息學(xué)方法對(duì)GSE74602的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，得到231個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中122個(gè)上調(diào)基因和1 0 9個(gè)下調(diào)基因。利用R語(yǔ)言中的pheatmap包繪制差異顯著的前20個(gè)上調(diào)基因和前20下調(diào)基因的的熱圖，這樣更能直觀的顯示出這些基因的表達(dá)差異結(jié)果。而且從該芯片通過(guò)篩選出度值（degree）大于10的40個(gè)基因，如表4所示。從表中可以看出度值位于前5的基因分別是，TOP2A、CDK1、CDC20、CCNB1、MAD2L1，值越大表明與惡性腫瘤的關(guān)系越密切。TOP2A是拓?fù)洚悩?gòu)酶2α的簡(jiǎn)稱，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶，并且能控制和改變DNA的拓?fù)涔δ軤顟B(tài)，它與染色體濃縮、染色單體分離、DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制期間發(fā)生的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力的緩沖等過(guò)程有一定的關(guān)系，研究[13]表明它的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可以作為腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。研究[14]表明TOP2A的高表達(dá)在乳腺癌和前列腺癌中提示預(yù)后不良，Cao等[15]指出TOP2A的高表達(dá)可作為胃癌患者的潛在生物標(biāo)志物，Zhou等[16]認(rèn)為T(mén)OP2A的表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路用來(lái)鑒定胰腺癌的進(jìn)展和預(yù)后。CDK1，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1的縮寫(xiě)，Gao等[17]證明KPNA2可以通過(guò)增加CDK1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并由此作為治療肝癌干預(yù)的指標(biāo)之一。在人類中，共有21個(gè)CDK基因，它們是細(xì)胞增殖，基因轉(zhuǎn)錄和mRNA加工的正調(diào)控因子，CDK4和CDK6在乳腺癌中被研究的最多，事實(shí)上，靶向CDK1或細(xì)胞周期蛋白B的藥物已被證明能有效阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[18]。CDK1能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移，延緩細(xì)胞周期和加速細(xì)胞凋亡，并通過(guò)聯(lián)合下調(diào)基因細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白D1和Bcl-2來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[19]。癌癥基因組圖譜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集揭示了人類結(jié)直腸癌中CDK1比正常結(jié)直腸要過(guò)度表達(dá)，CDK1是BRAFV600E結(jié)直腸癌中凋亡的新穎介質(zhì)，其與MEK抑制劑的雙重靶向結(jié)合可能是治療結(jié)直腸癌有效的途徑[20]。CDC20是細(xì)胞分裂周期20同系物的一種，它的過(guò)度表達(dá)以Bim依賴性方式促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系對(duì)多西他賽的耐藥性，將來(lái)很可能解決治療前列腺癌對(duì)多西他賽的耐藥性的問(wèn)題[21]。多變量分析顯示高CDC20表達(dá)是總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，CDC20上調(diào)基因與胃癌的侵襲性進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，可將CDC20鑒定為預(yù)測(cè)胃癌患者臨床預(yù)后分析的獨(dú)立標(biāo)記物[22]。CCNB1是細(xì)胞周期蛋白B1的簡(jiǎn)稱，被認(rèn)為是癌癥疫苗的潛在靶標(biāo)，因?yàn)樗谠S多惡性細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而在正常細(xì)胞中以幾乎檢測(cè)，像在包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌和頭頸部癌中的這幾種人類實(shí)體瘤中都觀察到過(guò)度表達(dá)[23]。MAD2L1基因反復(fù)參與細(xì)胞周期和有絲分裂的過(guò)程， 并發(fā)現(xiàn)MAD2L1高表達(dá)與肺癌預(yù)后不良有關(guān)，總之過(guò)度表達(dá)的MAD2L1有可能作為預(yù)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)和生存的預(yù)后生物標(biāo)志物[24]。

通過(guò)基因GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞內(nèi)的一碳代謝過(guò)程，細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞間的黏附等作用。眾多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)一碳代謝途徑一旦發(fā)生紊亂，會(huì)影響正常組織基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、變性，進(jìn)而導(dǎo)致正常組織發(fā)生癌變[25]。癌癥干細(xì)胞理論表明腫瘤細(xì)胞的發(fā)生是細(xì)胞的不對(duì)稱分裂來(lái)維持的，細(xì)胞的不對(duì)稱分裂又和分裂細(xì)胞的紡錘體形成密不可分[26]。細(xì)胞增殖和凋亡受細(xì)胞周期嚴(yán)密調(diào)控，一旦細(xì)胞周期發(fā)生紊亂將會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生細(xì)胞間的黏附。

從表2中可以看出，在生物學(xué)過(guò)程中，比較有意義的S100P、CCNB2、FASN這3個(gè)基因，它與結(jié)直腸癌有關(guān)的研究還不是很廣泛。S100P蛋白具有C-末端賴氨酸殘基，人類乳腺癌細(xì)胞中的S100P蛋白與患者生存率降低相關(guān)，它表達(dá)的值越高，表明在惡性腫瘤中的侵襲能力越強(qiáng)[27]。S100P高表達(dá)在各種惡性腫瘤中，并且在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，并與結(jié)直腸癌的侵入和轉(zhuǎn)移相關(guān)，然而在調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討[28]。CCNB2是細(xì)胞周期蛋白家族的一種，在G2/M周期轉(zhuǎn)換的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，高水平的CCNB2蛋白與腫瘤分化程度，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān)，同時(shí)，CCNB2蛋白過(guò)表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后不良因素之一[29]。脂肪酸合成酶（FASN）是從頭合成長(zhǎng)鏈脂肪酸所需的關(guān)鍵酶，F(xiàn)ASN通常在人類癌癥中高度表達(dá)，而在大多數(shù)正常人類組織中通常不可檢測(cè)或表現(xiàn)低表達(dá)，其表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，可能由對(duì)藥物或輻射的抗性介導(dǎo)有關(guān)，盡管FASN的表達(dá)在各種類型的癌癥中，但其與非小細(xì)胞肺癌中的放射敏感性的關(guān)聯(lián)尚不清楚，還需進(jìn)一步研究[30]。上述3個(gè)基因雖然在人類惡性腫瘤中高度表達(dá)，代表其預(yù)后較差，但在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚，還需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與細(xì)胞周期，以及p53信號(hào)傳導(dǎo)通路。細(xì)胞周期是在DNA損傷之后影響細(xì)胞增值、生長(zhǎng)以及細(xì)胞分裂的一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)因子，而且細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的缺失能夠促進(jìn)基因不穩(wěn)定性的發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞增值異常誘發(fā)癌癥[31]。Han等[32]發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子sp1的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡以及細(xì)胞周期的停滯，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Zheng等[33]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞分裂周期蛋白Parafibromin能夠抑制結(jié)直腸癌的分裂周期的進(jìn)行，最終使結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，并且為結(jié)直腸癌的基因治療提供新的潛在的靶點(diǎn)。Chen等[34]發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的核糖體蛋白S15A能夠通過(guò)p53信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，并且引起p53信號(hào)通路的錯(cuò)誤調(diào)控。

為了進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，本研究對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)分析以及子網(wǎng)絡(luò)模塊分析，發(fā)現(xiàn)了一些新的與結(jié)直腸癌發(fā)展有關(guān)的基因，如KIF20A、CENPF、NCAPG、PYY、IQGAP3，這些可能成為將來(lái)結(jié)直腸癌潛在的診斷、治療的靶點(diǎn)和分子標(biāo)志物。KIF20A是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族成員的一員，在細(xì)胞分裂中起著重要的作用[35]，而且在黑色素瘤、膀胱癌中都能顯著過(guò)表達(dá)。在胰腺癌細(xì)胞中敲除KIF20A能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移以及侵襲能力[36-37]。KIF20A在原發(fā)性肝癌中是顯著過(guò)表達(dá)的，與肝癌患者的預(yù)后有著密切關(guān)系[38]。KIF20A的高表達(dá)與乳腺癌的惡化以及紫杉醇耐藥有著密切關(guān)系[39]。但KIF20A在結(jié)直腸癌中的作用及機(jī)制我們還尚不清楚，需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

CENPF是著絲粒蛋白家族中的一員，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中染色體的分離起著重要作用[40]。肝細(xì)胞肝癌中，CENPF對(duì)癌細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，但是能夠明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且CENPF的過(guò)表達(dá)與5氟類化療藥的耐藥有著密切的關(guān)系[41]。CENPF的表達(dá)與染色體不穩(wěn)定性，c-myc擴(kuò)增以及端粒酶活性有密切聯(lián)系，而且過(guò)度表達(dá)CENPF的乳腺癌患者預(yù)后較差[42]。因此，CENPF可能會(huì)成為一個(gè)新的潛在的基因治療靶點(diǎn)。NCAPG是凝集素復(fù)合物I的一個(gè)亞基，在細(xì)胞減數(shù)分裂染色體分離過(guò)程中起重要作用[43]，NCAPG不僅能夠抑制高分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，沉默NCAPG能夠引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞停滯在G1期。iRNA-137能夠通過(guò)抑制NCAPG的表達(dá)從而表現(xiàn)出抗腫瘤的活性[44]。另外，miRNA137在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出抑癌作用，因此，NCAPG在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中可能起著促進(jìn)癌基因的作用。

PYY由36個(gè)氨基酸的肽組成，是胰腺多肽和神經(jīng)肽Y構(gòu)成的肽類家族的一員，也是遠(yuǎn)端腸道最豐富內(nèi)分泌調(diào)節(jié)肽，低水平的PYY和腸道病變的惡性程度有著密切的關(guān)系[45]。而且PYY能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制Barrets食管癌細(xì)胞的增殖[46-47]。另外，PPY及其合成類似物可能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，從而抑制乳腺癌的增長(zhǎng)[48-49]。PYY不僅有緩解胰腺炎的作用，而且隨著PYY濃度的升高以及暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制胰腺癌生長(zhǎng)的作用就越明顯[50-51]。

IQGAP3是IQ模體GTP酶激活蛋白家族中最新被發(fā)現(xiàn)的一員，而且IOGAP3僅表達(dá)在大腦、肺、睪丸、小腸以及直腸中[52]。QGAP3有著與IQGAP1高達(dá)60%的相似結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期的發(fā)生，并且激活Ras依賴的ERK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖，發(fā)揮癌基因的作用[53]，另外，IQGAP3能夠通過(guò)增強(qiáng)EGFR介導(dǎo)的ERK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[54]，因此，IQGAP3在結(jié)直腸癌發(fā)展中也可能發(fā)揮著重要作用。

此外，本研究通過(guò)cMap篩選出了103個(gè)小分子藥物，本文中列舉了前10個(gè)小分子藥物。紫霉素是富集分?jǐn)?shù)絕對(duì)值最高的一種小分子藥物，它是一種堿性多肽抗生素，是抗多藥耐藥結(jié)核病最有效的藥物之一，它而且能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并能抑制惡變細(xì)胞的增值，根據(jù)這一機(jī)制將來(lái)有可能成為治療惡性腫瘤的小分子藥物[55]。去甲駱駝蓬堿是一種β-咔啉生物堿，在當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)項(xiàng)目中表現(xiàn)出顯著的重要性。它能改變含有細(xì)胞毒性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和能量的特異性，進(jìn)一步為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了研究機(jī)制[56]。斑鳩霉素是一種具有強(qiáng)抗原生動(dòng)物和細(xì)胞毒活性的抗生素。斑鳩霉素是一種先前的抗生素，已被證明可抑制巨噬細(xì)胞中氧化低密度脂蛋白的攝取，這樣就間接的保護(hù)了人體免疫細(xì)胞，未來(lái)有可能作為抗腫瘤藥物的制劑。上述經(jīng)篩選的潛在小分子藥物，像紫霉素、去甲駱駝蓬堿、斑鳩霉素等都有可能成為治療結(jié)直腸癌的新型藥物。

總而言之，本研究采用生物信息學(xué)方法篩選結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸組織之間的差異表達(dá)基因，并進(jìn)行基因的GO功能富集分析以及KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在癌癥相關(guān)的細(xì)胞分裂、增殖、黏附等生物學(xué)過(guò)程，以及與癌癥有關(guān)的細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路，從而更好的了解結(jié)直腸癌發(fā)生的機(jī)制。而且本研究還發(fā)現(xiàn)一些新的在結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中起著核心作用的基因及潛在的治療結(jié)直腸癌的小分子藥物，如新型基因：KIF20A、CENPF、NCAPG、PYY和IQGAP3及紫霉素、去甲駱駝蓬堿、斑鳩霉素等小分子藥物。為結(jié)直腸癌的診斷與治療提供了潛在的標(biāo)志物和靶點(diǎn)。這些都為理解結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中復(fù)雜的分子機(jī)制提供新的思路，也為臨床進(jìn)一步的對(duì)抗腫瘤藥物的研究提供了大量依據(jù)，然而，考慮到本基礎(chǔ)研究有一定的局限性，未來(lái)還需要進(jìn)一步更深入的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究的結(jié)果。

[1]Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87–108. doi: 10.3322/caac.21262.

[2]Aran V, Victorino AP, Thuler LC, et al. Colorectal Cancer:Epidemiology, Disease Mechanisms and Interventions to Reduce Onset and Mortality[J]. Clin Colorectal Cancer, 2016, 15(3):195–203. doi: 10.1016/j.clcc.2016.02.008.

[3]Nannini M, Pantaleo MA, Maleddu A, et al. Gene expression profiling in colorectal cancer using microarray technologies:results and perspectives[J]. Cancer Treat Rev, 2009, 35(3):201–209. doi: 10.1016/j.ctrv.2008.10.006.

[4]Cardoso J, Boer J, Morreau H, et al. Expression and genomic profiling of colorectal cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2007,1775(1):103–137.

[5]Chan SK, Griffith OL, Tai IT, et al. Meta-analysis of colorectal cancer gene expression profiling studies identifies consistently reported candidate biomarkers[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008, 17(3):543–552. doi: 10.1158/1055–9965.EPI-07–2615.

[6]Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc, 2009, 4(1):44–57. doi:10.1038/nprot.2008.211.

[7]Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology (GO) project in 2006[J]. Nucleic Acids Res, 2006, 34(Database issue):D322–326.

[8]Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al. Gene ontology: tool for the unif i cation of biology. The Gene Ontology Consortium[J]. Nat Genet, 2000, 25(1):25–29.

[9]Saito R, Smoot ME, Ono K, et al. A travel guide to Cytoscape plugins[J]. Nat Methods, 2012, 9(11):1069–1076. doi: 10.1038/nmeth.2212.

[10]von Mering C, Huynen M, Jaeggi D, et al. STRING: a database of predicted functional associations between proteins[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(1):258–261.

[11]Lamb J, Crawford ED, Peck D, et al. The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease[J]. Science, 2006, 313(5795):1929–1935.

[12]Cuyle PJ, Prenen H. Current and future biomarkers in the treatment of colorectal cancer[J]. Acta Clin Belg, 2017,72(2):103–115. doi: 10.1080/17843286.2016.1262996.

[13]Tsavaris N, Lazaris A, Kosmas C, et al. Topoisomerase I and IIalpha protein expression in primary colorectal cancer and recurrences following 5-fluorouracil-based adjuvant chemotherapy[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2009, 64(2):391–398. doi: 10.1007/s00280–008–0886–4.

[14]Zheng H, Li X, Chen C, et al. Quantum dot-based immunof l uorescent imaging and quantitative detection of TOP2A and prognostic value in triple-negative breast cancer[J]. Int J Nanomedicine, 2016, 11:5519–5529.

[15]Cao Y, Zhang G, Wang P, et al. Clinical signif i cance of UGT1A1 polymorphism and expression of ERCC1, BRCA1, TYMS,RRM1, TUBB3, STMN1 and TOP2A in gastric cancer[J]. BMC Gastroenterol, 2017, 17(1):2. doi: 10.1186/s12876–016–0561-x.

[16]Zhou Z, Liu S, Zhang M, et al. Overexpression of Topoisomerase 2-Alpha Confers a Poor Prognosis in Pancreatic Adenocarcinoma Identified by Co-Expression Analysis[J]. Dig Dis Sci, 2017,62(10):2790–2800. doi: 10.1007/s10620–017–4718–4.

[17]Gao CL, Wang GW, Yang GQ, et al. Karyopherin subunit-alpha 2 expression accelerates cell cycle progression by upregulating CCNB2 and CDK1 in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett,2018, 15(3):2815–2820. doi: 10.3892/ol.2017.7691.

[18]Reese JM, Bruinsma ES, Monroe DG, et al. ERbeta inhibits cyclin dependent kinases 1 and 7 in triple negative breast cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(57):96506–96521. doi: 10.18632/oncotarget.21787.

[19]Pu S, Zhao Y, Zhou G, et al. Effect of CDK1 shRNA on proliferation, migration, cell cycle and apoptosis in non-small cell lung cancer[J]. J Cell Physiol, 2017, doi: 10.1002/jcp.26387.[Epub ahead of print]

[20]Zhang P, Kawakami H, Liu W, et al. Targeting CDK1 and MEK/ERK Overcomes Apoptotic Resistance in BRAF-Mutant Human Colorectal Cancer[J]. Mol Cancer Res, 2018, 16(3):378–389. doi:10.1158/1541–7786.MCR-17–0404.

[21]Guo W, Zhong K, Wei H, et al. Long non-coding RNA SPRY4-IT1 promotes cell proliferation and invasion by regulation of Cdc20 in pancreatic cancer cells[J]. PLoS One, 2018, 13(2):e0193483. doi:10.1371/journal.pone.0193483.

[22]Ding ZY, Wu HR, Zhang JM, et al. Expression characteristics of CDC20 in gastric cancer and its correlation with poor prognosis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(2):722–727.

[23]Chevaleyre C, Benhamouda N, Favry E, et al. The Tumor Antigen Cyclin B1 Hosts Multiple CD4 T Cell Epitopes Differently Recognized by Pre-Existing Naive and Memory Cells in Both Healthy and Cancer Donors[J]. J Immunol, 2015, 195(4):1891–1901. doi: 10.4049/jimmunol.1402548.

[24]Shi YX, Zhu T, Zou T, et al. Prognostic and predictive values of CDK1 and MAD2L1 in lung adenocarcinoma[J]. Oncotarget,2016, 7(51):85235–85243. doi: 10.18632/oncotarget.13252.

[25]Myte R, Gylling B, H?ggstr?m J, et al. Untangling the role of one-carbon metabolism in colorectal cancer risk: a comprehensive Bayesian network analysis[J]. Sci Rep, 2017, 7:43434. doi:10.1038/srep43434.

[26]Powell AE, Shung CY, Saylor KW, et al. Lessons from development: A role for asymmetric stem cell division in cancer[J]. Stem Cell Res, 2010, 4(1):3–9. doi: 10.1016/j.scr.2009.09.005.

[27]Clarke CJ, Gross SR, Ismail TM et al. Activation of tissue plasminogen activator by metastasis-inducing S100P protein[J]. Biochem J, 2017, 474(19):3227–3240. doi: 10.1042/BCJ20170578.

[28]Zuo Z, Zhang P, Lin F, et al. Interplay between Trx-1 and S100P promotes colorectal cancer cell epithelial-mesenchymal transition by up-regulating S100A4 through AKT activation. J Cell Mol Med. 2018 Apr;22(4):2430–2441. doi: 10.1111/jcmm.13541.

[29]Qian X, Song X, He Y, et al. CCNB2 overexpression is a poor prognostic biomarker in Chinese NSCLC patients[J].Biomed Pharmacother, 2015, 74:222–227. doi: 10.1016/j.biopha.2015.08.004.

[30]Zhan N, Li B, Xu X, et al. Inhibition of FASN expression enhances radiosensitivity in human non-small cell lung cancer[J].Oncol Lett, 2018, 15(4):4578–4584. doi: 10.3892/ol.2018.7896.

[31]Malumbres M, Barbacid M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9(3):153–166. doi:10.1038/nrc2602.

[32]Han D, Cho JH, Lee RH, et al. Antitumorigenic effect of atmospheric-pressure dielectric barrier discharge on human colorectal cancer cells via regulation of Sp1 transcription factor[J].Sci Rep, 2017, 7:43081. doi: 10.1038/srep43081.

[33]Zheng HC, Liu JJ, Li J, et al. The in vitro and vivo effects of nuclear and cytosolic paraf i bromin expression on the aggressive phenotypes of colorectal cancer cells: a search of potential gene therapy target[J]. Oncotarget, 2017, 8(14):23603–23612. doi:10.18632/oncotarget.15377.

[34]Chen J, Wei Y, Feng Q, et al. Ribosomal protein S15A promotes malignant transformation and predicts poor outcome in colorectal cancer through misregulation of p53 signaling pathway[J]. Int J Oncol, 2016, 48(4):1628–1638. doi: 10.3892/ijo.2016.3366.

[35]Fontijn RD, Goud B, Echard A, et al. The human kinesin-like protein RB6K is under tight cell cycle control and is essential for cytokinesis[J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(8):2944–2955. doi:10.1128/MCB.21.8.2944–2955.2001

[36]Taniuchi K, Nakagawa H, Nakamura T, et al. Down-regulation of RAB6KIFL/KIF20A, a kinesin involved with membrane trafficking of discs large homologue 5, can attenuate growth of pancreatic cancer cell[J]. Cancer Res, 2005, 65(1):105–112.

[37]Stangel D, Erkan M, Buchholz M, et al. Kif20a inhibition reduces migration and invasion of pancreatic cancer cells[J]. J Surg Res,2015, 197(1):91–100. doi: 10.1016/j.jss.2015.03.070.

[38]Shi C, Huang D, Lu N, et al. Aberrantly activated Gli2-KIF20A axis is crucial for growth of hepatocellular carcinoma and predicts poor prognosis[J]. Oncotarget, 2016, 7(18):26206–26219. doi:10.18632/oncotarget.8441.

[39]Khongkow P, Gomes AR, Gong C, et al. Paclitaxel targets FOXM1 to regulate KIF20A in mitotic catastrophe and breast cancer paclitaxel resistance[J]. Oncogene, 2016, 35(8):990–1002.doi: 10.1038/onc.2015.152.

[40]Varis A, Salmela AL, Kallio MJ. Cenp-F (mitosin) is more than a mitotic marker[J]. Chromosoma, 2006, 115(4):288–295.

[41]Kim HE, Kim DG, Lee KJ, et al. Frequent amplification of CENPF, GMNN and CDK13 genes in hepatocellular carcinomas[J]. PLoS One, 2012, 7(8):e43223. doi: 10.1371/journal.pone.0043223.

[42]O'Brien SL, Fagan A, Fox EJ, et al. CENP-F expression is associated with poor prognosis and chromosomal instability in patients with primary breast cancer[J]. Int J Cancer 2007,120(7):1434–1443.

[43]Hirano T. Condensins: organizing and segregating the genome[J].Curr Biol, 2005, 15(7):R265–275.

[44]Liang ML, Hsieh TH, Ng KH, T et al. Downregulation of miR-137 and miR-6500–3p promotes cell proliferation in pediatric high-grade gliomas[J]. Oncotarget, 2016, 7(15):19723–19737. doi:10.18632/oncotarget.7736.

[45]Adrian TE, Ballantyne GH, Zucker KA, et al. Lack of peptide YY immunoreactivity in adenomatous colonic polyps: evidence in favor of an adenoma-carcinoma sequence[J]. J Surg Res, 1988,44(5):561–565.

[46]McFadden DW, Riggs DR, Jackson BJ, et al. Peptide YY inhibits the growth of Barrett's esophageal adenocarcinoma in vitro[J]. Am J Surg, 2004, 188(5):516–519.

[47]Tatemoto K. Isolation and characterization of peptide YY(PYY), a candidate gut hormone that inhibits pancreatic exocrine secretion[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1982, 79(8):2514–2518.

[48]Grisé KR, Rongione AJ, Laird EC, et al. Peptide YY inhibits growth of human breast cancer in vitro and in vivo[J]. J Surg Res,1999, 82(2):151–155.

[49]Heisler T, Towf i gh S, Simon N, et al. Peptide YY and vitamin E inhibit hormone-sensitive and -insensitive breast cancer cells[J]. J Surg Res, 2000, 91(1):9–14.

[50]Liu CD, Kwan D, Simon N, et al. Synthetic peptide YY analog binds to a cell membrane receptor and delivers fl uorescent dye to pancreatic cancer cells[J]. J Gastrointest Surg, 2001, 5(2):147–152.

[51]Liu CD, Rongione AJ, Garvey L, et al. Adjuvant hormonal treatment with peptide YY or its analog decreases human pancreatic carcinoma growth[J]. Am J Surg, 1996, 171(1):192–196.

[52]Wang S, Watanabe T, Noritake J, et al. IQGAP3, a novel effector of Rac1 and Cdc42, regulates neurite outgrowth[J]. J Cell Sci,2007, 120(Pt 4):567–577.

[53]Nojima H, Adachi M, Matsui T, et al. IQGAP3 regulates cell proliferation through the Ras/ERK signalling cascade[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(8):971–978. doi: 10.1038/ncb1757.

[54]Yang Y, Zhao W, Xu QW, et al. IQGAP3 promotes EGFR-ERK signaling and the growth and metastasis of lung cancer cells[J].PLoS One, 2014,9(5):e97578. doi: 10.1371/journal.pone.0097578.

[55]Holm M, Borg A, Ehrenberg M, et al. Molecular mechanism of viomycin inhibition of peptide elongation in bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(4):978–983. doi: 10.1073/pnas.1517541113.

[56]Sarkar S, Bhadra K. Therapeutic role of harmalol targeting nucleic acids: Biophysical perspective and in vitro cytotoxicity[J]. Mini Rev Med Chem, 2017, doi: 10.2174/138955751866617121116483 0. [Epub ahead of print]