胃癌組織YAP1、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)及臨床意義

肖磊，黃昌浩，袁偉杰，陳晉湘，駱晴晴，陳子華

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1. 胃腸外科 2. 腫瘤科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有95萬(wàn)例診斷為胃癌，2012年全球因胃癌死亡72.3萬(wàn)例[1]。在我國(guó)，胃癌在總體腫瘤發(fā)生和死亡例數(shù)中均居于第2位[2]。胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)是導(dǎo)致胃癌患者死亡的重要原因。而目前胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不清楚。因此，研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探尋有效的早期診斷及轉(zhuǎn)移預(yù)警標(biāo)志物，對(duì)于提高胃癌治療療效，改善胃癌患者預(yù)后具有十分重要的意義，也一直是胃癌研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有上皮形態(tài)和功能的細(xì)胞由于極性消失、細(xì)胞間連接丟失、細(xì)胞骨架重排從而表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣特征的生理與病理學(xué)過(guò)程[3]。多項(xiàng)研究顯示，EMT進(jìn)程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，能調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞特性，如抗失巢凋亡、抗細(xì)胞衰老、免疫抑制、化療耐藥、干細(xì)胞特性的獲得與維持以及腫瘤相關(guān)炎癥等。其使腫瘤細(xì)胞間的黏附能力減弱、生存能力及侵入間質(zhì)的能力增強(qiáng)，因此成為腫瘤細(xì)胞脫離腫瘤母體向周圍組織侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要起始事件。在諸多實(shí)體腫瘤如胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌的研究中，EMT被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要進(jìn)程。E-cadherin是上皮樣細(xì)胞的重要細(xì)胞膜標(biāo)志物，在EMT進(jìn)程中表達(dá)降低；與之相反，N-cadherin是間質(zhì)樣細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在EMT進(jìn)程中表達(dá)升高。許多信號(hào)通路如TGF-β/Smad、Ras/MAPK、Notch、Wnt/β-catenin和Hippo等參與調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生。

YAP1（Yes-association protein 1）是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵性信號(hào)分子，Hippo信號(hào)通路最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，具有高度保守性，通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持器官發(fā)育至正常體積[4]。腫瘤細(xì)胞中Hippo通路活性通常處于抑制狀態(tài)，參與多種腫瘤細(xì)胞特性如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、干細(xì)胞特性以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的獲得與調(diào)控[5]，YAP1入核后與TEAD等結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。目前多項(xiàng)最新研究表明，在肝癌[7]、肺癌[8]、宮頸癌[9]等惡性實(shí)體腫瘤中，YAP1可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。但在胃癌的研究中，尚缺乏基于臨床病理學(xué)資料的研究。而目前許多研究表明，EMT是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)，且胃癌脈管侵犯和淋巴轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的的重要標(biāo)之一[10]。筆者推測(cè)，在胃癌組織中，YAP1通過(guò)促進(jìn)EMT進(jìn)程參與促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年6月—2016年6月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院胃腸外科進(jìn)行根治性胃癌手術(shù)（D2）患者組織標(biāo)本共135例，其中男99例，女36例。上述患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及靶向藥物等治療。術(shù)前經(jīng)胃鏡病理檢查確診為胃癌。術(shù)中腫塊離體后半小時(shí)內(nèi)取明顯癌變組織（去除壞死組織）及距離腫瘤＞5 cm正常胃黏膜組織作為對(duì)照。術(shù)后分期參照2018年第8版UICC/AJCC推薦TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后采取電話隨訪，患者術(shù)后隨訪＞12個(gè)月，主要采集患者術(shù)后治療、復(fù)發(fā)及生存狀態(tài)等相關(guān)情況，術(shù)后患者復(fù)發(fā)以影像學(xué)依據(jù)為主。

1.2 試劑

兔抗人E-cadherin（3195S）單克隆抗體購(gòu)置于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，YAP1（abs115219）、N-cadherin（abs109031）購(gòu)置于中國(guó)上海愛(ài)必信生物科技有限公司（YAP1稀釋濃度1:200），免疫組化試劑盒（SP法）購(gòu)置于北京中杉金橋公司。

1.3 胃癌組織芯片制作

將胃癌/癌旁組織常規(guī)脫水后包埋，切片后行HE染色。經(jīng)2名病理科醫(yī)師鏡下診斷為胃癌并標(biāo)記癌組/正常黏膜部位。取2 mm孔徑穿刺針垂直穿入癌組/正常黏膜對(duì)應(yīng)石蠟塊。按事先標(biāo)記順序排列芯片石蠟組織，再次包埋（注意黏膜面/腫瘤面朝切面）。切片后再次HE染色明確取樣部位。

1.4 免疫組化

將組織芯片石蠟切片（0.4 mm），經(jīng)過(guò)烤片→二甲苯→梯度酒精→雙氧水（3%）→檸檬酸鈉→一抗孵育過(guò)夜（抗體稀釋濃度YAP1 1:200；E-cadherin 1:500；N-cadherin 1:500）→二抗孵育→生物素孵育→DAB顯色→蘇木素染核→鹽酸酒精反藍(lán)→封片。將染色后玻片全景掃描，采用CaseViewer系統(tǒng)分別取×5、×10、×200、×400截圖后檢測(cè)免疫組化染色強(qiáng)度。

1.5 結(jié)果判讀

YAP1表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，N-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。結(jié)果判讀：200倍鏡下胃癌細(xì)胞YAP1染色面積/總面積：0～25%為1，26～50%為2，51～75%為3，＞75%為4；染色強(qiáng)度：未染色及淡黃色為1，黃色為2，棕黃色為3，再將染色面積×染色強(qiáng)度所得積分組成半定量結(jié)果?？偡e分＜7分為陰性表達(dá)（-），＞7為陽(yáng)性表達(dá)（+）[11]。N-cadherin[12]、E-cadherin[13]依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)估：無(wú)（0），淡黃色（+），黃色（++）棕黃色（+++），細(xì)胞膜染色（+++）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中計(jì)數(shù)資料顯著性比較采用χ2檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料、等級(jí)資料比較采用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 YAP1、E-cadherin以及N-cadherin在胃癌組織及正常胃黏膜組織中表達(dá)

YAP1在癌組織中表達(dá)總體呈黃色或棕黃色，染色均一，部分細(xì)胞核染色。在正常胃黏膜組織中表達(dá)呈淡黃色或黃色，表達(dá)不均一，自基底膜至游離緣胃黏膜細(xì)胞中免疫組化染色逐層變淡。癌組織中YAP1染色積分明顯高于癌旁黏膜組織（P＜0.0001）（圖1）（表1）。

圖1 47例胃癌/癌旁胃黏膜組織芯片YAP1染色及局部不同放大倍數(shù)圖（×5，×400）Figure1 Images of immunohistochemical staining for YAP1 in tissue microarray containing 47 cases of gastric cancer/adjacent tissue and local regions with different magnif i cations (×5, ×400)

表1 YAP1在135例胃癌/癌旁組織中表達(dá)評(píng)分（n）Table 1 Immunohistochemical scores of YAP1 in the 135 cases of gastric cancer/adjacent gastric mucoca (n)

E-cadherin在胃癌組織中表達(dá)呈黃色或淡黃色，在癌旁黏膜組織中表達(dá)呈棕黃色，且細(xì)胞膜呈強(qiáng)陽(yáng)性，E-cadherin胃癌中陽(yáng)性表達(dá)顯著低于癌旁組織表達(dá)（P＜0.01）；N-cadherin在胃癌中表達(dá)呈棕黃色和黃色，在癌旁黏膜組織中呈現(xiàn)黃色或淡黃色，或陰性表達(dá)，且自基底膜至游離緣胃黏膜細(xì)胞中免疫組化染色逐層變淡，N-cadherin胃癌中陽(yáng)性表達(dá)與癌旁組織表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）（表2）。

圖2 免疫組化檢測(cè)E-cadherin與N-cadherin表達(dá) A-B：分別為芯片中胃癌組織與癌旁組織E-cadherin表達(dá)（×5）；C-D：分別為芯片中胃癌組織與癌旁組織N-cadherin表達(dá)（×5）；E-H：局部高倍圖（×400）Figure 2 Immunohistochemical staining for E-cadherin and N-cadherin expressions A–B: E-cadherin expressions in tissue microarray with gastric cancer and adjacent tissues (×5); C–D: N-cadherin expressions in tissue microarray with gastric cancer and adjacent tissues(×5); E–H: High magnif i cation images of local regions (×400)

表2 E-cadherin和N-cadherin在135例胃癌/癌旁組織中的表達(dá)（n）Table 2 The expressions of E-cadherin and N-cadherin in 135 cases of gastric cancer/adjacent gastric tissues（n）

2.2 YAP1與E-cadherin、N-cadherin在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，YAP1、E-cadherin和N-cadherin均為等級(jí)資料。經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，在胃癌組織中，YAP1與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.273，P=0.032），YAP1與N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.304，P=0.019）。

2.3 YAP1與胃癌患者臨床病理學(xué)因素間相關(guān)性分析

統(tǒng)計(jì)胃癌組織芯片中YAP1的免疫組化表達(dá)結(jié)果，分別分析其與患者臨床病理因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)YAP1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及神經(jīng)、脈管侵犯存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是，YAP1表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表3）。

2.4 YAP1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

用Kaplan-Meier生存分析方法描述YAP1的表達(dá)對(duì)胃癌患者1年內(nèi)生存情況的影響，所觀測(cè)結(jié)局為出現(xiàn)以影像學(xué)為依據(jù)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或因腫瘤復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡，發(fā)現(xiàn)YAP1陽(yáng)性表達(dá)組的總的生存率明顯低于陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.354，P=0.037）（圖3）。

表3 YAP1表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素間的關(guān)系[n（%）]Table 3 Relations of YAP1 expression with clinicopathologic variables of gastric cancer patients [n (%)]

圖3 YAP1陽(yáng)性與陰性患者生存曲線Figure 3 Survival curves of patients with positive and negative YAP1 expression

3 討 論

胃癌依然是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，尤其是在亞洲。在過(guò)去的10年里，胃癌的治療模式已發(fā)生了很大變化[14]，但胃癌致死率仍然極高，是中國(guó)發(fā)病率和病死率都居前三的腫瘤[15]，其原因可能是胃癌患者早期癥狀不明顯，又缺乏敏感的早期診斷標(biāo)記物，導(dǎo)致許多患者就診時(shí)已并非早期，盡管目前胃癌診療技術(shù)有了較大突破，但各項(xiàng)研究顯示進(jìn)展期胃癌患者5年生存率并未得到顯著提高，因此研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制，具有重要的臨床意義。YAP1作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物各組織器官中，在正常組織中，YAP1受Hippo信號(hào)通路其他信號(hào)分子如Lats1/2、Mst1/2、Sav1、MOB1/2等調(diào)控[16]，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大作用，其中，YAP1入核為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵事件。在YAP1入核后，特異性與TEAD等蛋白結(jié)合，共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子作用，促進(jìn)DNA的轉(zhuǎn)錄[17]。在生理情況下，Hippo信號(hào)受多種膜信號(hào)調(diào)控，YAP1受多種信號(hào)分子激活后磷酸化，阻斷其入核，減少對(duì)核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄的激動(dòng)，使組織器官維持原有體積。然而器官在幼年或損傷階段時(shí)，Hippo信號(hào)通路受到抑制，從而使YAP1入核增加，促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖。而在最近一系列研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中YAP1表達(dá)增高，特別是在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)，表明YAP1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文探討了YAP1在胃癌中的表達(dá)情況 ，并探討其表達(dá)與胃癌患者相關(guān)臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

最近研究[7-8]發(fā)現(xiàn)YAP1可通過(guò)誘導(dǎo)EMT從而參與肝癌、肺癌侵襲轉(zhuǎn)移，同年，惠慧等[18]也報(bào)道在宮頸癌細(xì)胞中通過(guò)沉默YAP1的表達(dá)可以明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖及侵襲能力，上述研究在一定程度上與本研究結(jié)果相符。本研究顯示，與正常組織相比，YAP1在胃癌組織中表達(dá)較正常組織普遍升高（49.6%vs.25.2%，P=0.000），且細(xì)胞核陽(yáng)性僅出現(xiàn)在癌組織中，考慮其與胃癌腫瘤發(fā)生、過(guò)度增殖相關(guān)。另外本研究發(fā)現(xiàn)，與YAP1陰性表達(dá)組相比，其陽(yáng)性表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著增加（58.5%vs.39.0%，P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素[19]，與此同時(shí)，YAP1陽(yáng)性表達(dá)組脈管侵犯顯著增加（65.1%vs.38.8%，P＜0.05），上述結(jié)果表明YAP1可以促進(jìn)胃癌侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)，目前認(rèn)為癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位向淋巴結(jié)以及最近和最遠(yuǎn)的組織和器官播散的能力是惡性腫瘤的基本特征，是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[20]，而且胃癌組織中神經(jīng)及脈管侵犯被認(rèn)為是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的的重要標(biāo)志[10]。因此YAP1可以視為預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯的重要輔助診斷分子。另外，本研究通過(guò)Kaplan-Meier生存分析顯示YAP1陽(yáng)性表達(dá)組生存率明顯低于陰性表達(dá)組，從而表明YAP1陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差。同樣國(guó)內(nèi)Li等[21]研究也發(fā)現(xiàn)YAP1表達(dá)與胃癌預(yù)后不良相關(guān)。胃癌患者約40%在術(shù)后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，YAP1對(duì)于胃癌預(yù)示不良預(yù)后具有重大的臨床意義，但本次研究隨訪期限為術(shù)后1年，因此更長(zhǎng)時(shí)間的追蹤隨訪筆者及其所在的課題組將繼續(xù)隨訪。

EMT是胚胎發(fā)育和組織修復(fù)的重要機(jī)制，但目前研究發(fā)現(xiàn)，EMT也有助于疾病的進(jìn)展，特別的最近研究證實(shí)EMT在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中其關(guān)鍵作用，同樣YAP1與EMT相關(guān)性令人矚目，多項(xiàng)研究表明在膠質(zhì)瘤[22]、前列腺癌[23]、結(jié)直腸癌[24]中YAP1通過(guò)介導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT相關(guān)信號(hào)分子包括E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin、snail等，其中E-cadherin與EMT呈負(fù)相關(guān)，余信號(hào)分子均與EMT呈正相關(guān)。EMT多發(fā)生于原位腫瘤中，而在轉(zhuǎn)移癌中，多呈現(xiàn)MET狀態(tài)，即間質(zhì)樣腫瘤細(xì)胞向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換。在本研究中，通過(guò)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析YAP1與E-cadherin及N-cadherin在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)YAP1在胃癌組織中的表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.273，P=0.032），與N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.304，P=0.019），提示YAP1可能參與胃癌EMT進(jìn)程，從而與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-cadherin在胃癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)，E-cadherin與腫瘤EMT發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。但在本研究中N-cadherin在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步確認(rèn)。

目前，國(guó)內(nèi)外已有大量基礎(chǔ)研究證明YAP1與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但目前對(duì)于YAP1與胃癌的相關(guān)性的研究并不多見，本研究通過(guò)免疫組化分析初步探討YAP1與胃癌臨床病理相關(guān)因素及其預(yù)后的關(guān)系，具有一定的創(chuàng)新性。綜上所述，YAP1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，提示其與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并通過(guò)促進(jìn)EMT進(jìn)程在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。特別是，YAP1表達(dá)上調(diào)與胃癌術(shù)后患者早期復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，因此，提示YAP1的表達(dá)對(duì)胃癌患者早期預(yù)后的判定具有一定的臨床指導(dǎo)作用。

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