胃癌細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT2的表達(dá)及其作用

鄧浩，劉磊

（1. 湖北省武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430015；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 胃腸外科，湖北 武漢 430014）

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，僅在2012年，胃癌新發(fā)病例就估計(jì)有95萬(wàn)左右，其中死亡人數(shù)72萬(wàn)，在不同的國(guó)家和地區(qū)，胃癌的發(fā)病率有很大差異[1]。在我國(guó)，胃癌發(fā)病率及病死率位列第二[2]。目前，胃癌主要的治療手段包括手術(shù)及放化療，但是由于多數(shù)患者在確診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差[1]。因此，尋找可靠的生物標(biāo)志物作為臨床早期診療的靶點(diǎn)具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA，在基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及表觀遺傳等多個(gè)水平調(diào)控基因表達(dá)，在多種疾病中也有重要的作用[3-4]。lncRNA CCAT2最早在2013年被發(fā)現(xiàn)并鑒定出來(lái)，其序列定位于8q24高度保守區(qū)域[5]。CCAT2在結(jié)直腸癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、食管鱗癌[7]、前列腺癌[8]等腫瘤中異常高表達(dá)，發(fā)揮類似于原癌基因的功能。本研究旨在體外研究CCAT2在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及敲低其表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、Hs746T、BSG823及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，P53、caspase-8、Bcl-2及Bax一抗均購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司，二抗購(gòu)自美國(guó)BD公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，LncRNA CCAT2 siRNA套裝購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司。RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，HBS-1096B酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，蛋白免疫印跡電泳設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、Hs746T、BSG823及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1均種植于RPMI 1640培養(yǎng)基，并培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，于48 h后消化傳代，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

取胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS分成3組，si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，并制備終濃度為80 nmol/L的LncRNA CCAT2 siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物，將AGS細(xì)胞系以每孔2×105個(gè)接種于6孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合后，si-CCAT2組和陰性對(duì)照組經(jīng)LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染CCAT2 siRNA序列和陰性對(duì)照siRNA序列，空白對(duì)照組以PBST為空白對(duì)照。CCAT2 siRNA序列正義鏈：5'-AGG UGU AGC CAG AGU UAA UTT-3'，反義鏈：5'-AUU AAC UCU GGC UAC ACC UTT-3'；陰性對(duì)照siRNA序列正義鏈：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反義鏈：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'。

1.2.2 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR） RNA的提?。菏占郎y(cè)細(xì)胞系和3組細(xì)胞，每孔不少于1×106個(gè)細(xì)胞，用All-in-One miRNA抽提試劑盒提取總RNA，取5 μg總RNA行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，LncRNA CCAT2引物序列正向：5'-CCC TGG TCA AAT TGC TTA ACC T-3'，反向：5'-TTA TTC GTC CCT CTG TTT TAT GG AT-3'；GAPDH引物序列正 向：5'-GCT CTC TGC TCC TCC TGT TC-3'，反 向：5'-ACG ACC AAA TCC GTT GAC TC-3'。行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，使用BIORAD real-time PCR儀自帶軟件分析樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），采用 2?ΔΔCt方法定量，計(jì)算LncRNA CCAT2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 CCK-8法測(cè)定si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組3組細(xì)胞增殖能力，將si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，以2×103個(gè)/孔將3組細(xì)胞種植于96孔板上，每個(gè)孔按200 μL的體積上樣，經(jīng)0、24、48、72、96 h培養(yǎng)后，20 μL CCK-8溶液加入于每孔中去，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在450 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定si-CCAT2組、陰性對(duì)照組兩組細(xì)胞凋亡率，染色采用Annexin V/PI，將si-CCAT2組、陰性對(duì)照組兩組細(xì)胞消化后，結(jié)合緩沖液重懸混勻后，加入Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液及PI染料，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)確定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力測(cè)定 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，將si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿融合后，用20 μL無(wú)菌Tips槍頭畫(huà)直線，在0 h和48 h在顯微鏡下觀察修復(fù)情況，劃痕愈合率的計(jì)算按照公式，即劃痕愈合率=（劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積）/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)在同一情況及條件下重復(fù)測(cè)量3次。遷移能力與劃痕愈合率成正比。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力測(cè)定 采用Transwell實(shí)驗(yàn)將si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組3組細(xì)胞，每組取3×104個(gè)細(xì)胞后接種于Transwell小室表面，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，24h后，將小室膜下面的細(xì)胞用甲醛固定，并采用0.2%結(jié)晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)10個(gè)200×視野，計(jì)算膜下細(xì)胞數(shù)，在同一條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲細(xì)胞數(shù)越多表示侵襲能力越強(qiáng)。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 將si-CCAT2組、陰性對(duì)照組兩組細(xì)胞裂解、變性后，上樣量為每孔30 μg蛋白，濃縮膠條件為50 min 80 V，分離膠條件為100 min 100 V，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，加入P53、caspase-8、Bcl-2及Bax一抗，濃度為1:200，4℃孵育過(guò)夜，二抗（1:1000）經(jīng)37 ℃孵育4 h后，PBST漂洗3次，在ECL發(fā)光液下顯影，Quantity One 1-D分析目標(biāo)蛋白灰度值，目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，3組比較先用方差分析，有意義時(shí)，兩兩比較再用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCAT2在胃癌細(xì)胞系與正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR示，正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1中LncRNA CCAT2相對(duì)表達(dá)量為1.0±0.03，在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、Hs746T及BSG823中相對(duì)表達(dá)量分別為8.52±0.43、5.67±0.31及3.49±0.18，胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、Hs746T及BSG823中LncRNA CCAT2相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 CCAT2在胃癌及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 Expressions of CCAT2 in different gastric cancer cell lines and normal gastric cell line

圖2 敲低CCAT2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的影響 A：CCAT2相對(duì)表達(dá)量；B：細(xì)胞增殖曲線Figure 2 Effect of knockdown of CCAT2 expression on gastric cancer cells A: Relative CCAT2 expression levels; B: Cell proliferation curves

2.2 敲低CCAT2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

胃癌細(xì)胞系A(chǔ) G S轉(zhuǎn)染2 4 h后，q R T-P C R示，si-CCAT2組LncRNA CCAT2相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.021，陰性對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為1.0±0.04，空白對(duì)照組為1.06±0.07，si-CCAT2組LncRNA CCAT2相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功（圖2A）。

轉(zhuǎn)染0、2 4，4 8 h后，C C K-8實(shí)驗(yàn)示，si-CCAT2組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組間OD450nm值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染后72、96 h，si-CCAT2組OD450nm值低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間各時(shí)間點(diǎn)OD450nm值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖2B）。

2.3 敲低CCAT2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示，si-CCAT2組細(xì)胞凋亡率為（15.7±1.1）%，陰性對(duì)照組凋亡率為（4.5±0.63）%，si-CCAT2組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡Figure 3 Apoptosis of the gastric cancer cells detected by fl ow cytometry

2.4 敲低CCAT2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖4 遷移和侵襲能力檢測(cè)結(jié)果 A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)；B：Transwell實(shí)驗(yàn)Figure 4 Migration and invasion ability analyses A: Cell scratch assay; B: Transwell assay

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)示，s i-C C A T 2組劃痕愈合率為（2 2.9 1±2.1 6）%，陰性對(duì)照組為（5 3.5 7±4.8 1）%，s i-C C A T 2組劃痕愈合率低于陰性對(duì)照組（P＜0.0 5）（圖4 A）；Transwell實(shí)驗(yàn)示，200倍視野下，si-CCAT2組侵襲細(xì)胞數(shù)為（116.9±7.5）個(gè)，陰性對(duì)照組為（231.6±15.8）個(gè)，si-CCAT2組侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組（P＜0.01）（圖4B）。

2.5 敲低CCAT2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞P53、caspase-8和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Western blot示，si-CCAT2組與陰性對(duì)照組P53、caspase-8、Bcl-2及Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（3.42±0.21）vs.（1.0±0.04）、（2.74±0.17）vs.（1.0±0.03）、（0.46±0.03）vs.（1.0±0.0 3）及（2.2 8±0.1 4）v s.（1.0±0.0 3）；與陰性對(duì)照組比較，P 5 3、si-CCAT2組caspase-8、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 5 Western blot analyses of the expressions of the apoptosis-associated proteins

3 討 論

在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中排名第二[2]。目前，胃癌的治療包括手術(shù)和放化療，但大多數(shù)患者在確診時(shí)已是進(jìn)展期，預(yù)后較差，5年生存率低于30%[9-11]。

lncRNA廣泛存在于基因組中，其沒(méi)有開(kāi)放閱讀框，能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、基因組印記和染色體修飾等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)生物體發(fā)育、機(jī)體代謝和多種疾病有密切的關(guān)系[12]。lncRNA CCAT2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)會(huì)影響到癌基因myc表達(dá)，且可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，研究[5]認(rèn)為這可能是通過(guò)影響TCF7L2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)了myc、miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CCAT2能夠影響到Wnt信號(hào)通路。在非小細(xì)胞肺癌中，CCAT2表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)上調(diào)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，下調(diào)CCAT2表達(dá)后，可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]。在食管鱗癌中，CCAT2高表達(dá)與患者吸煙史相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)CCAT2在3種胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)，這提示其在胃癌中具有類似于原癌基因的功能。本研究通過(guò)敲低CCAT2來(lái)檢測(cè)其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)敲低CCAT2可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時(shí)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。在膽囊癌[13]中，CCAT2高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)侵犯、TNM分級(jí)及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，敲低CCAT2表達(dá)可抑制增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。胰腺導(dǎo)管腺癌[14]中， CCAT2在胰腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，且與預(yù)后差相關(guān)，敲低其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖和侵襲。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]中，CCAT2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤大小及分級(jí)相關(guān)，高表達(dá)CCAT2的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較低表達(dá)者差，沉默其表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)早期凋亡，CCAT2可調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)。在前列腺癌中，敲低CCAT2表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，且是影響前列腺癌預(yù)后的獨(dú)立影響因子[8]。在卵巢癌[16]中，沉默CCAT2表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞系HeLa增殖，并誘導(dǎo)凋亡。在肝細(xì)胞癌[17]中，CCAT2起著癌基因的功能，調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、遷移和凋亡過(guò)程。

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，P53是著名的抑癌基因，可通過(guò)接收到細(xì)胞內(nèi)的各種損傷和凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡通路；而下游的caspase-8是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，是控制細(xì)胞凋亡進(jìn)程的核心酶，通過(guò)接收上游凋亡信號(hào)，caspase-8能對(duì)多個(gè)蛋白裂解，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其通常是細(xì)胞凋亡水平的指標(biāo)之一。Bcl-2能通過(guò)改變線粒體中的氧化還原水平和線粒體膜通透性來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡，bax是Bcl-2家族最廣泛的促凋亡蛋白，這些蛋白都是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的標(biāo)志物[18-24]。本研究對(duì)下游的凋亡標(biāo)志性基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)P53、caspase-8和bax顯著上調(diào)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)顯著下調(diào)，這提示敲除CCAT2能激活凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

由于是體外研究，本研究尚存在一定的不足，比如：CCAT2在胃癌組織中的表達(dá)如何，與預(yù)后的關(guān)系如何，在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)如何，都值得進(jìn)一步的研究，這也是后續(xù)的研究方向。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，CCAT2在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，敲低CCAT2的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與P53、caspase-8和bax上調(diào)及Bcl-2下調(diào)表達(dá)有關(guān)，這為更深一步的闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視野。

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