• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)動態(tài)突變檢測中的應(yīng)用研究

    2018-05-07 06:59:30陳園園郝瑩張瑾張鑫謝坤銘丁銘顧衛(wèi)紅
    關(guān)鍵詞:毛細(xì)管核苷酸電泳

    陳園園 郝瑩 張瑾 張鑫 謝坤銘 丁銘 顧衛(wèi)紅

    三核苷酸重復(fù)序列疾?。═RD)系致病基因內(nèi)三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)在細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)生動態(tài)突變,異常擴(kuò)展導(dǎo)致的一組遺傳性疾病。正常人攜帶的三核苷酸重復(fù)序列在一定范圍內(nèi)存在多態(tài)性,并在代間傳遞過程中保持穩(wěn)定。當(dāng)重復(fù)序列拷貝數(shù)超過一定閾值時呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性,部分呈現(xiàn)出逐代擴(kuò)展趨勢。目前已發(fā)現(xiàn)30余種由三核苷酸異常擴(kuò)展導(dǎo)致的疾?。??3],相關(guān)重復(fù)序列包括胞嘧啶?腺嘌呤?鳥嘌呤(CAG)、胞嘧啶?胞嘧啶?鳥嘌呤(CCG)、鳥嘌呤?腺嘌呤?腺嘌呤(GAA)、胞嘧啶?胸腺嘧啶?鳥嘌呤(CTG)和鳥嘌呤?胞嘧啶?鳥嘌呤(GCG),主要位于基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和非翻譯區(qū)。脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA)有9種亞型屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病,即SCA1型、SCA2型、SCA3型、SCA6型、SCA7型、SCA8型、SCA12型、SCA17型和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮(DRPLA),三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展次數(shù)通常<200次;此外,亨廷頓?。℉D,致病基因為IT15基因)、類亨廷頓病2型(致病基因為JPH3基因)、脊髓延髓肌萎縮癥(SBMA,致病基因為SBMA基因)等也屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病。

    三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測可以采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析、克隆測序、直接測序和蛋白印跡法等技術(shù),其中,蛋白印跡法操作繁瑣,已較少用于常規(guī)基因檢測。目前的常規(guī)檢測方法是基于毛細(xì)管電泳的片段分析。本研究采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測14例脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者(包括3例SCA2型、2例SCA7型、7例SCA8型和2例SCA17型)致病基因三核苷酸重復(fù)序列,比較兩種方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

    對象與方法

    一、研究對象

    研究對象為2005年8月-2016年5月中日友好醫(yī)院運動障礙與神經(jīng)遺傳病研究中心收集的臨床擬診為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系先證者,選取其中的SCA2型3例、SCA7型2例、SCA8型7例和SCA17型2例共14例,均為漢族,男性10例,女性4例;年齡10~58歲,平均(33.42±13.62)歲。本研究經(jīng)中日友好醫(yī)院道德倫理委員會審核批準(zhǔn),所有受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.樣本采集 所有受試者空腹采集外周靜脈血各5 ml,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝,采用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿DNA提取法提取基因組DNA。

    2.三核苷酸重復(fù)序列突變分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、瓊脂糖凝膠電泳和基于毛細(xì)管電泳的片段分析進(jìn)行脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)致病基因動態(tài)突變分析。(1)PCR反應(yīng):在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因重復(fù)序列,基于重復(fù)片段兩側(cè)序列采用Primer 3.0軟件設(shè)計引物序列并進(jìn)行同源比對,由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,SCA2基因正向引物(F引物)序列:5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3',反向引物(R引物)序列:5'?CGGGCTTGCGGACATTGG?3';SCA7 基因正向引 物 (F引 物 ) 序 列 :5'?GGAGTCGAAAGCGAAAGCTA?3',反向引物(R 引物)序列:5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3';SCA8基 因 正 向 引 物(F引 物 ) 序 列 :5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3',反向引物(R 引 物 ) 序 列 :5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3';SCA17基因正向引物(F引物)序列:5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3',反向引物(R引物)序列:5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。熒光引物序列由上海普邁生物科技有限公司合成,SCA7、SCA8和SCA17基因正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記,SCA2基因引物采用熒光標(biāo)記M13末端加尾法標(biāo)記。SCA2基因正向引物(F引物)序列:5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3',反向引物(R 引物 +M13引 物 ) 序 列 :5'?CACGACGTTGTAAAACGACCGGGCTTGCGGAATT?GG?3';SCA7基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?TTTTTTGTTACATTGTAGGAGCG?3',反向引物(R引物)序列:5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3';SCA8基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3',反向引物(R 引 物 ) 序 列 :5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3';SCA17基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3',反向引物(R引物)序列:5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。PCR 反應(yīng)體系共 25 μl,依次加入 dNTPs 2.50 mmol,2× GC 緩沖液Ⅰ12.50 μl,SCA2、SCA7、SCA8 和 SCA17 基因正向引物和反向引物各5 pmol,模板DNA 100 ng,Taq酶1 U,加滅菌去離子水補充至25 μl。SCA2基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,以94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s循環(huán)35次,72℃延伸10 min;SCA7基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃ 50 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min,每個循環(huán)減1℃共循環(huán)15次,94 ℃ 50 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,共循環(huán)29次,72℃延伸10 min;SCA8基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃ 45 s、69℃ 30 s、72℃ 2 min,每個循環(huán)減0.50℃共循環(huán)20次,94℃45 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min,共循環(huán)10次,72 ℃延伸10 min;SCA17基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,循環(huán)35次,72 ℃延伸10 min。(2)瓊脂糖凝膠電泳:取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的瓊脂糖凝膠電泳,電壓100 V,電泳50 min,對于出現(xiàn)2條電泳條帶的樣品進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析。(3)基于毛細(xì)管電泳的片段分析:采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的CEQ?8000核酸分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段分析,包括 20 μl甲酰胺,以 0.25 μl CEQ DNA Size Standard Kit?600 片段作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo),1 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后上樣;預(yù)設(shè)程序進(jìn)行電泳分離,分離條件為毛細(xì)管溫度達(dá)50℃時,90℃變性120 s,電壓2 kV下注入樣本30 s、電壓4.80 kV下電泳70 min,以預(yù)設(shè)分析參數(shù)進(jìn)行片段分析。

    3.三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)計算 在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因及其包含的三核苷酸重復(fù)序列,在CEQ?8000核酸分析儀Analysis Parameters窗口STR Locus Tag界面設(shè)置重復(fù)次數(shù)與片段長度的對應(yīng)關(guān)系,以SCA17基因為例:正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記,擴(kuò)增出287 bp片段,此片段包含38次CAG重復(fù)序列,因此設(shè)置CAG重復(fù)序列與片段長度的關(guān)系時,以287 bp對應(yīng)38次CAG重復(fù)序列為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)置。采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的GenomelabTMGeXP Genetic Analysis System軟件,以GS?600 LIZ片段為相對分子質(zhì)量標(biāo)記,計算樣本擴(kuò)增片段長度,并自動生成擴(kuò)增片段包含的重復(fù)序列。

    4.動態(tài)突變的克隆測序 將14例樣本送檢寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行克隆測序,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別切膠回收后,克隆至TaKaRa pMD?18?T載體,選取陽性克隆進(jìn)行DNA測序,計算CAG重復(fù)序列。

    結(jié) 果

    一、SCA2基因CAG重復(fù)序列分析

    對3例 SCA2型患者(編號:A15?71、A15?25和A16?9)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA2正常等位基因CAG重復(fù)序列為14~32次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為33~77次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為31、30和32次;毛細(xì)管電泳峰形特征為,大多數(shù)正常重復(fù)序列為單一銳利主峰,其右側(cè)有一矮峰,而擴(kuò)展重復(fù)序列為簇狀低矮爪形峰,CAG重復(fù)序列的計數(shù)以中間高峰為準(zhǔn)(圖1)。對3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序,其結(jié)果顯示,CAG重復(fù)序列分別為37/40/40、37/38/39和38/39/40次;每例樣本的不同克隆測序結(jié)果CAG重復(fù)序列存在差異,且同一例樣本的不同克隆測序結(jié)果亦存在堿基差異。

    表1 SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序結(jié)果Table 1. Results of expanded repeats numbers of SCA2,SCA7,SCA8 and SCA17 genes detected by capillary electrophoresis and clone sequencing

    二、SCA7基因CAG重復(fù)序列分析

    對2例SCA7型患者(編號:A20?13和 A20?13?2)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA7正常等位基因CAG重復(fù)序列為4~27次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為37~200次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,2例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為57和34次。對A20?13樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠回收克隆測序,第1次獲得的CAG重復(fù)序列為85次,第2次選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序,CAG重復(fù)序列分別為69、74和75次;對A20?13?2樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行的克隆測序,CAG重復(fù)序列為45次。

    三、SCA8基因CTA/CTG重復(fù)序列分析

    對7例SCA8型患者的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA8正常等位基因重復(fù)序列為15~37次,異常等位基因重復(fù)序列>100次,某些個體攜帶中間重復(fù)等位基因?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為99、111、104、92、89、104和75次??寺y序顯示,7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為97、116、104、90、90、102和76次。

    圖1 SCA2基因毛細(xì)管電泳峰形圖顯示,正常片段呈單一銳利主峰(黑箭頭所示),擴(kuò)展重復(fù)序列呈簇狀低矮爪形峰(紅箭頭所示)Figure 1 Capillary electrophoresis of SCA2 gene. Normal amplicon showed a single sharp main peak(black arrow indicates)and expanded repeats showed a cluster of low claw?shaped peak(red arrow indicates).

    四、SCA17基因CAG重復(fù)序列分析

    對2例SCA17型患者(編號:A20?33和A19?45)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA17正常等位基因CAG重復(fù)序列25~42次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為45~66次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,2例樣本短片段/擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為37/50和36/45次??寺y序顯示,A20?33樣本3個菌落短片段重復(fù)序列為37/36/36次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為51/50/52次,A19?45樣本2個菌落短片段重復(fù)序列為36/35次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為45/44次。

    討 論

    三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變是一種特殊的突變方式,多種疾病表現(xiàn)為患病后代的異常重復(fù)序列進(jìn)一步擴(kuò)展,導(dǎo)致發(fā)病年齡提前、疾病進(jìn)展加快,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和婚育。我們研究團(tuán)隊多年來致力于對此類突變患者進(jìn)行常規(guī)檢測,包括基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序,積累較為豐富的臨床經(jīng)驗。

    基于毛細(xì)管電泳的片段分析有以下幾方面特點:(1)穩(wěn)定性佳,如本研究SCA7基因A20?13樣本,我們研究團(tuán)隊曾對多個樣本進(jìn)行重復(fù)分析,結(jié)果完全一致。(2)存在問題,相關(guān)基因CAG重復(fù)區(qū)及其兩側(cè)GC含量升高,導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物遷移行為不同于堿基隨機(jī)組成的片段,毛細(xì)管電泳采用變性后的單鏈DNA,可以在電泳時產(chǎn)生“發(fā)卡”形二級結(jié)構(gòu),形成局部不完全堿基互補的雙鏈DNA,導(dǎo)致DNA鏈變短,如果以GC含量相對均衡的內(nèi)參照物作為對照,判讀的單鏈DNA長度小于 實 際 長 度[4?6]。 本 研 究 SCA2 和 SCA7 基 因CAG重復(fù)序列基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果均小于克隆測序結(jié)果。陳樸等[4]的研究顯示,SCA2和SCA7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高遷移率與其重復(fù)序列兩側(cè)GC含量升高密切相關(guān),究其原因可能是由于側(cè)翼GC含量升高可以增加單鏈DNA形成更加復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的機(jī)會,從而使DNA鏈進(jìn)一步縮短,對其遷移率產(chǎn)生更加顯著的影響。

    克隆測序有以下幾方面特點:(1)其優(yōu)點是可視性佳,直觀。(2)其缺點是步驟繁瑣;切膠時難以完全分開短片段和長片段;克隆過程中DNA復(fù)制忠實性較低,結(jié)果不穩(wěn)定。本研究對3例SCA2基因樣本行多個克隆測序,結(jié)果均不同,且出現(xiàn)多種堿基突變;對SCA7基因同一樣本的擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠克隆測序,結(jié)果亦存在明顯差異。克隆測序結(jié)果的不穩(wěn)定性可能與大腸桿菌中序列異常重組有關(guān),使三核苷酸產(chǎn)生不穩(wěn)定性擴(kuò)增[7?9]。轉(zhuǎn)入大腸桿菌的重組雙鏈 DNA 在 CTG?CAG處發(fā)生DNA雙鏈斷裂,產(chǎn)生2個缺口,遂在斷裂缺口處以其他雙鏈DNA為模板,在大腸桿菌復(fù)制和修復(fù)功能作用下經(jīng)組合形成新的雙鏈DNA。與斷裂前相比,重新組合的雙鏈DNA CAG重復(fù)序列擴(kuò)展。在基因重組過程中,CAG重復(fù)序列越多、越易形成“發(fā)卡”形結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定 CAG 序列[7,10?13]。

    采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測SCA2和SCA7基因擴(kuò)展重復(fù)序列存在顯著差異,而SCA8和SCA17基因擴(kuò)展重復(fù)序列差異不顯著,究其原因,可能是由于SCA2和SCA7基因CAG重復(fù)序列較單純,在代間傳遞過程中易擴(kuò)展[14?15];SCA8和SCA17基因重復(fù)序列不單純,尤其是SCA17基因,重復(fù)序列包含多個胞嘧啶?腺嘌呤?腺嘌呤(CAA)序列,可能對重復(fù)序列具有穩(wěn)定作用[16?17]。

    通過長期的大量實驗和數(shù)據(jù)積累,我們認(rèn)為,基于毛細(xì)管電泳的片段分析是檢測基因動態(tài)突變的穩(wěn)定、可靠方法,在判讀重復(fù)序列時存在的差異是可以預(yù)知的,而且方法便于操作,適用于常規(guī)基因檢測。與此同時,我們結(jié)合家系患者的臨床表型特點和代間傳遞規(guī)律,對基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果進(jìn)行判讀,以保證基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    近年來,基因測序技術(shù)發(fā)展迅速,但是目前應(yīng)用較為廣泛的二代基因測序由于讀長所限,難以對三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變進(jìn)行檢測。2013年,Loomis等[18]采用單分子實時測序(SMRT)首次獲得脆性X染色體綜合征(FRAX)基因三核苷酸重復(fù)序列的全長信息,為三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測提供新的技術(shù)。

    [1]Orr HT,Zoghbi HY.Trinucleotide repeat disorders[J].Annu Rev Neurosci,2007,30:575?621.

    [2]Ellegren H.Heterogeneous mutation processes in human microsatellite DNA sequences[J].Nat Genet,2000,24:400 ?402.

    [3]Bauer PO, Nukina N. The pathogenic mechanisms of polyglutamine diseases and current therapeutic strategies[J].J Neurochem,2009,110:1737?1765.

    [4]Chen P,Ma MY,Shang HF,Su D,Zhang SZ,Yang Y.Copy number variation of trinucleotide repeat in dynamic mutation sites of autosomal dominant cerebellar ataxias related genes[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2009,26:626?633[.陳樸,馬明義,商慧芳,蘇丹,張思仲,楊元.常染色體顯性小腦性共濟(jì)失調(diào)致病基因動態(tài)突變位點三核苷酸重復(fù)變異的研究[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2009,26:626?633.]

    [5]Nakagawa T,Ueda M,Baba Y.Separation of triplet repeat DNA by capillary electrophoresis and the conformational analysis by atomic force microscope[J].Nucleic Acids Symp Ser,2000,44:67?68.

    [6]Kiba Y,Baba Y.Unusual capillary electrophoretic behavior of triplet repeat DNA[J].J Biochem Biophys Methods,1999,41:143?151.

    [7]Zheng QJ,Gan SR,Wang N,Wu ZY.The reliability of cloning?sequencing to detect the number of trinucleotide repeats[J].Zhonghua Shen Jing Ke Za Zhi,2010,43:659?663[.鄭巧娟,甘世銳,王檸,吳志英.克隆測序方法檢測三核苷酸重復(fù)次數(shù)的可靠性[J].中華神經(jīng)科雜志,2010,43:659?663.]

    [8]Jakupciak JP,Wells RD.Gene conversion (recombination)mediates expansions of CTG·CAG repeats[J].J Biol Chem,2000,275:40003?40013.

    [9]Jakupciak JP,Wells RD.Genetic instabilities of triplet repeat sequences by recombination[J].IUBMB Life,2000,50:355?359.

    [10]Wells RD,Parniewski P,Pluciennik A.Small slipped register genetic instabilities in Escherichia coli in triplet repeat sequences associated with hereditary neurological diseases[J].J Biol Chem,1998,273:19532?19541.

    [11]Usdin K,Woodford KJ.CGG repeats associated with DNA instability and chromosome fragility form structures that block DNA synthesis in vitro[J].Nucleic Acid Res,1995,23:4202 ?4209.

    [12]Mitas M,Yu A,Dill J,Haworth IS.The trinucleotide repeat sequence d(CGG)15 forms a heat?stable hairpin containing Gsyn.Ganti base pairs[J].Biochemistry,1995,34:12803 ?12811.

    [13]Gacy AM,Goellner G,Juranic N,Macura S,McMurray CT.Trinucleotide repeats thatexpand in human disease form hairpin structures in vitro[J].Cell,1995,81:533?540.

    [14]Wang CR,Jiang H.Progress study on the mechanism of CAG repeats dynamic mutation in polyQ disease[J].Zhongguo Xian Dai Shen Jing Ji Bing Za Zhi,2012,12:363?366.[王 春 榮, 江宏.多聚谷氨酰胺病CAG重復(fù)序列動態(tài)突變機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2012,12:363?366.]

    [15]Ramos EM,Martins S,Alonso I,Emmel VE,Saraiva?Pereira ML,Jardim LB,Coutinho P,Sequeiros J,Silveira I.Common origin of pure and interrupted repeat expansions in spinocerebellar ataxia type 2(SCA2)[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2010,153B:524?531.

    [16]Gao R,Matsuura T,Coolbaugh M,Zühlke C,Nakamura K,Rasmussen A,Siciliano MJ,Ashizawa T,Lin X.Instability of expanded CAG/CAA repeats in spinocerebellar ataxia type 17[J].Eur J Hum Genet,2008,16:215?222.

    [17]Tomiuk J,Bachmann L,Bauer C,Rolfs A,Sch?ls L,Roos C,Zischler H,Schuler MM,Bruntner S,Riess O,Bauer P.Repeat expansion in spinocerebellar ataxia type 17 alleles of the TATA?box binding protein gene:an evolutionary approach[J].Eur J Hum Genet,2007,15:81?87.

    [18]Loomis EW,Eid JS,Peluso P,Yin J,Hickey L,Rank D,McCalmon S,Hagerman RJ,Tassone F,Hagerman PJ.Sequencing the unsequenceable:expanded CGG?repeat alleles of the fragile X gene[J].Genome Res,2013,23:121?128.

    猜你喜歡
    毛細(xì)管核苷酸電泳
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
    徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    毛細(xì)管氣相色譜法測定3-氟-4-溴苯酚
    云南化工(2020年11期)2021-01-14 00:50:54
    輔助陽極在輕微型廂式車身電泳涂裝中的應(yīng)用
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    PPG第四屆電泳涂料研討會在長沙成功舉辦
    上海建材(2017年4期)2017-04-06 07:32:03
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測胸腺肽分子量
    超聲萃取-毛細(xì)管電泳測定土壤中磺酰脲類除草劑
    毛細(xì)管氣相色譜法測定自釀葡萄酒中甲醇的含量
    中藥與臨床(2015年5期)2015-12-17 02:39:28
    用毛細(xì)管電泳檢測牦牛、犏牛和藏黃牛乳中β-乳球蛋白的三種遺傳變異體
    亚洲三区欧美一区| а√天堂www在线а√下载| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久热在线av| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲,欧美精品.| 丝袜美腿诱惑在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久青草综合色| 欧美日韩精品网址| 精品国产一区二区三区四区第35| 两个人视频免费观看高清| 国产极品粉嫩免费观看在线| 我的亚洲天堂| 亚洲专区国产一区二区| 国产又爽黄色视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99久久精品国产亚洲精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩欧美三级三区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日本熟妇午夜| 久久国产乱子伦精品免费另类| 成人免费观看视频高清| 午夜激情福利司机影院| 成人一区二区视频在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 桃色一区二区三区在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产亚洲欧美98| 在线国产一区二区在线| 午夜福利在线在线| 性色av乱码一区二区三区2| 免费在线观看亚洲国产| 美国免费a级毛片| 国产精品影院久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久午夜亚洲精品久久| 黄色毛片三级朝国网站| 91字幕亚洲| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色精品久久人妻99蜜桃| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲av片天天在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆一二三区av精品| ponron亚洲| 亚洲久久久国产精品| 中亚洲国语对白在线视频| 极品教师在线免费播放| 最近在线观看免费完整版| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人18禁在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 18禁观看日本| 日本免费一区二区三区高清不卡| av视频在线观看入口| 国产爱豆传媒在线观看 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91麻豆av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜老司机福利片| 美女 人体艺术 gogo| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜福利免费观看在线| 久久亚洲精品不卡| 国产高清激情床上av| 亚洲专区国产一区二区| 久久青草综合色| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲av第一区精品v没综合| 免费在线观看完整版高清| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美日韩精品网址| 久久香蕉精品热| 99国产精品一区二区三区| 国产高清videossex| 中亚洲国语对白在线视频| av中文乱码字幕在线| 高清毛片免费观看视频网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美乱色亚洲激情| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久人妻av系列| 最新在线观看一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品久久久人人做人人爽| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 曰老女人黄片| 在线国产一区二区在线| 国产高清videossex| 免费在线观看成人毛片| 一本一本综合久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 自线自在国产av| 国产午夜福利久久久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 丁香六月欧美| 国产精品 欧美亚洲| 久热爱精品视频在线9| 中文资源天堂在线| 精品国产国语对白av| 午夜免费鲁丝| 脱女人内裤的视频| av福利片在线| 三级毛片av免费| 国产真实乱freesex| 国产精品精品国产色婷婷| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美在线二视频| 成人三级做爰电影| 精品久久久久久久久久久久久 | 色尼玛亚洲综合影院| 日韩有码中文字幕| 高清毛片免费观看视频网站| 国产伦人伦偷精品视频| 91av网站免费观看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品av久久久久免费| 国产精品久久久久久精品电影 | 精品免费久久久久久久清纯| 国产欧美日韩一区二区三| 草草在线视频免费看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲片人在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产真人三级小视频在线观看| av天堂在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久中文看片网| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 韩国精品一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲真实伦在线观看| 日韩欧美 国产精品| 午夜福利高清视频| 在线观看66精品国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品人妻少妇| 亚洲片人在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲成a人片在线一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人欧美大片| 精品国产国语对白av| 国产免费男女视频| 女同久久另类99精品国产91| 岛国在线观看网站| 精品国产国语对白av| 精品不卡国产一区二区三区| 自线自在国产av| 国产av在哪里看| 91成人精品电影| 亚洲国产精品999在线| 男女午夜视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费在线观看影片大全网站| 日本黄色视频三级网站网址| 精品国产亚洲在线| 波多野结衣高清无吗| av中文乱码字幕在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲最大成人中文| 精品国产亚洲在线| 国产精品久久久久久精品电影 | 99国产精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 精品人妻1区二区| 免费看a级黄色片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品九九99| 久久精品影院6| 亚洲中文av在线| 免费观看人在逋| 99riav亚洲国产免费| 欧美性猛交黑人性爽| av在线天堂中文字幕| 麻豆av在线久日| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美在线二视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产黄片美女视频| 在线观看www视频免费| 波多野结衣高清无吗| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲美女黄片视频| 久久99热这里只有精品18| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费看a级黄色片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丰满的人妻完整版| 一区二区日韩欧美中文字幕| 天堂√8在线中文| 哪里可以看免费的av片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美黑人精品巨大| 欧美在线黄色| 丁香欧美五月| 91字幕亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 99热6这里只有精品| 成人三级做爰电影| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产伦在线观看视频一区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人特级黄色片久久久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产不卡一卡二| 精品久久久久久久末码| 亚洲精品av麻豆狂野| av中文乱码字幕在线| a在线观看视频网站| 一级毛片女人18水好多| 男女下面进入的视频免费午夜 | 中出人妻视频一区二区| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲av五月六月丁香网| 99在线人妻在线中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲成人久久爱视频| 国产99久久九九免费精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 色哟哟哟哟哟哟| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天添夜夜摸| 午夜激情福利司机影院| 午夜福利成人在线免费观看| 精品日产1卡2卡| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产精品999在线| 夜夜爽天天搞| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品在线观看二区| 久久精品91无色码中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣av一区二区av| 日韩高清综合在线| 精品高清国产在线一区| 国产主播在线观看一区二区| 少妇的丰满在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 哪里可以看免费的av片| 人妻久久中文字幕网| 成年版毛片免费区| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜久久久在线观看| 悠悠久久av| 国产伦人伦偷精品视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产三级在线视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品一区二区三区四区久久 | av片东京热男人的天堂| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 在线看三级毛片| 一级a爱视频在线免费观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 淫妇啪啪啪对白视频| 村上凉子中文字幕在线| 成人午夜高清在线视频 | 国内揄拍国产精品人妻在线 | 在线播放国产精品三级| 女性被躁到高潮视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| а√天堂www在线а√下载| 桃色一区二区三区在线观看| 级片在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 在线永久观看黄色视频| x7x7x7水蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人精品无人区| 日本一本二区三区精品| 美女午夜性视频免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老司机深夜福利视频在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲美女黄片视频| 久久久久九九精品影院| 中文字幕高清在线视频| 两个人免费观看高清视频| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日本熟妇午夜| 精华霜和精华液先用哪个| av在线天堂中文字幕| 99在线视频只有这里精品首页| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品一区av在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一进一出抽搐动态| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av在线天堂中文字幕| 国产高清videossex| 波多野结衣高清无吗| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 男人舔女人下体高潮全视频| 禁无遮挡网站| 中文字幕最新亚洲高清| 此物有八面人人有两片| 青草久久国产| 色老头精品视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 中出人妻视频一区二区| 男人舔奶头视频| 国产色视频综合| 欧美日本视频| 日韩欧美三级三区| xxxwww97欧美| 久久婷婷成人综合色麻豆| av视频在线观看入口| 午夜免费鲁丝| 婷婷六月久久综合丁香| 久99久视频精品免费| 国产精品一区二区免费欧美| 悠悠久久av| 免费看十八禁软件| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一二三四在线观看免费中文在| 成在线人永久免费视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产伦人伦偷精品视频| 看片在线看免费视频| 夜夜爽天天搞| 后天国语完整版免费观看| 黄片播放在线免费| 黄色女人牲交| 少妇的丰满在线观看| 日韩精品青青久久久久久| a在线观看视频网站| 国产精品野战在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩黄片免| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中文字幕久久专区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黄色 视频免费看| 1024视频免费在线观看| 手机成人av网站| 久久中文字幕一级| 91在线观看av| 国产一区二区激情短视频| xxx96com| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产区一区二久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜精品在线福利| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 午夜久久久久精精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲全国av大片| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日韩高清综合在线| 老司机在亚洲福利影院| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色综合婷婷激情| 两个人免费观看高清视频| www国产在线视频色| av天堂在线播放| 久99久视频精品免费| 丝袜在线中文字幕| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲九九香蕉| 久久久久久久久中文| www.999成人在线观看| 国产片内射在线| 一a级毛片在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 男人操女人黄网站| 国产成人av激情在线播放| 丰满的人妻完整版| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99热6这里只有精品| 黄色 视频免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一级毛片高清免费大全| АⅤ资源中文在线天堂| 黄片播放在线免费| 啦啦啦免费观看视频1| aaaaa片日本免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 日韩有码中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线观看日韩欧美| 老司机靠b影院| 高清毛片免费观看视频网站| 精品久久蜜臀av无| 国产精品综合久久久久久久免费| 制服诱惑二区| 亚洲精品在线美女| 精品欧美国产一区二区三| 中文亚洲av片在线观看爽| 99riav亚洲国产免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一级片免费观看大全| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产三级黄色录像| 怎么达到女性高潮| 亚洲久久久国产精品| 在线播放国产精品三级| 99精品欧美一区二区三区四区| 中文字幕av电影在线播放| 91成年电影在线观看| 中文资源天堂在线| 欧美zozozo另类| 女同久久另类99精品国产91| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品影院久久| 99久久综合精品五月天人人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 露出奶头的视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 18禁美女被吸乳视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 一级作爱视频免费观看| 精品电影一区二区在线| 一进一出抽搐动态| 午夜免费成人在线视频| 日本一区二区免费在线视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 成人亚洲精品av一区二区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品欧美一区二区三区在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 看片在线看免费视频| 国产一区二区在线av高清观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| avwww免费| av片东京热男人的天堂| 国产精品久久久av美女十八| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜视频精品福利| 亚洲成av人片免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 桃红色精品国产亚洲av| 妹子高潮喷水视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久久人人人人人| 久久这里只有精品19| 91成人精品电影| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久人人精品亚洲av| xxxwww97欧美| 亚洲自拍偷在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 热99re8久久精品国产| 国产精品影院久久| e午夜精品久久久久久久| 午夜福利18| 在线av久久热| 国产又爽黄色视频| 国产精品久久电影中文字幕| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 精品国产亚洲在线| 久久中文字幕一级| 男男h啪啪无遮挡| 久久久国产精品麻豆| 在线观看舔阴道视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产免费男女视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品av久久久久免费| av免费在线观看网站| 精品欧美国产一区二区三| 成人国产一区最新在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产男靠女视频免费网站| 女警被强在线播放| 男人舔女人的私密视频| 国产日本99.免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 成年免费大片在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 性欧美人与动物交配| 日本五十路高清| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲 国产 在线| av片东京热男人的天堂| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜福利在线在线| 久久久国产成人精品二区| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜久久久久精精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 韩国精品一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 无遮挡黄片免费观看| xxxwww97欧美| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 人妻久久中文字幕网| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 精品久久久久久久末码| 一区二区三区激情视频| 国产色视频综合| 日韩精品青青久久久久久| 中出人妻视频一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 极品教师在线免费播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男女视频在线观看网站免费 | 男男h啪啪无遮挡| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 婷婷精品国产亚洲av| 一级作爱视频免费观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产成人啪精品午夜网站| 免费高清视频大片| 黑人操中国人逼视频| 亚洲黑人精品在线| 免费在线观看影片大全网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲成人精品中文字幕电影| √禁漫天堂资源中文www| 岛国视频午夜一区免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩三级视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 91成人精品电影| 午夜老司机福利片| 午夜福利高清视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲专区字幕在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜久久久久精精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩三级视频一区二区三区|