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    基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)動態(tài)突變檢測中的應(yīng)用研究

    2018-05-07 06:59:30陳園園郝瑩張瑾張鑫謝坤銘丁銘顧衛(wèi)紅
    關(guān)鍵詞:毛細(xì)管核苷酸電泳

    陳園園 郝瑩 張瑾 張鑫 謝坤銘 丁銘 顧衛(wèi)紅

    三核苷酸重復(fù)序列疾?。═RD)系致病基因內(nèi)三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)在細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)生動態(tài)突變,異常擴(kuò)展導(dǎo)致的一組遺傳性疾病。正常人攜帶的三核苷酸重復(fù)序列在一定范圍內(nèi)存在多態(tài)性,并在代間傳遞過程中保持穩(wěn)定。當(dāng)重復(fù)序列拷貝數(shù)超過一定閾值時呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性,部分呈現(xiàn)出逐代擴(kuò)展趨勢。目前已發(fā)現(xiàn)30余種由三核苷酸異常擴(kuò)展導(dǎo)致的疾?。??3],相關(guān)重復(fù)序列包括胞嘧啶?腺嘌呤?鳥嘌呤(CAG)、胞嘧啶?胞嘧啶?鳥嘌呤(CCG)、鳥嘌呤?腺嘌呤?腺嘌呤(GAA)、胞嘧啶?胸腺嘧啶?鳥嘌呤(CTG)和鳥嘌呤?胞嘧啶?鳥嘌呤(GCG),主要位于基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和非翻譯區(qū)。脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA)有9種亞型屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病,即SCA1型、SCA2型、SCA3型、SCA6型、SCA7型、SCA8型、SCA12型、SCA17型和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮(DRPLA),三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展次數(shù)通常<200次;此外,亨廷頓?。℉D,致病基因為IT15基因)、類亨廷頓病2型(致病基因為JPH3基因)、脊髓延髓肌萎縮癥(SBMA,致病基因為SBMA基因)等也屬于三核苷酸重復(fù)序列疾病。

    三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測可以采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析、克隆測序、直接測序和蛋白印跡法等技術(shù),其中,蛋白印跡法操作繁瑣,已較少用于常規(guī)基因檢測。目前的常規(guī)檢測方法是基于毛細(xì)管電泳的片段分析。本研究采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測14例脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者(包括3例SCA2型、2例SCA7型、7例SCA8型和2例SCA17型)致病基因三核苷酸重復(fù)序列,比較兩種方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

    對象與方法

    一、研究對象

    研究對象為2005年8月-2016年5月中日友好醫(yī)院運動障礙與神經(jīng)遺傳病研究中心收集的臨床擬診為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系先證者,選取其中的SCA2型3例、SCA7型2例、SCA8型7例和SCA17型2例共14例,均為漢族,男性10例,女性4例;年齡10~58歲,平均(33.42±13.62)歲。本研究經(jīng)中日友好醫(yī)院道德倫理委員會審核批準(zhǔn),所有受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.樣本采集 所有受試者空腹采集外周靜脈血各5 ml,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝,采用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿DNA提取法提取基因組DNA。

    2.三核苷酸重復(fù)序列突變分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、瓊脂糖凝膠電泳和基于毛細(xì)管電泳的片段分析進(jìn)行脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)致病基因動態(tài)突變分析。(1)PCR反應(yīng):在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因重復(fù)序列,基于重復(fù)片段兩側(cè)序列采用Primer 3.0軟件設(shè)計引物序列并進(jìn)行同源比對,由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,SCA2基因正向引物(F引物)序列:5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3',反向引物(R引物)序列:5'?CGGGCTTGCGGACATTGG?3';SCA7 基因正向引 物 (F引 物 ) 序 列 :5'?GGAGTCGAAAGCGAAAGCTA?3',反向引物(R 引物)序列:5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3';SCA8基 因 正 向 引 物(F引 物 ) 序 列 :5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3',反向引物(R 引 物 ) 序 列 :5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3';SCA17基因正向引物(F引物)序列:5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3',反向引物(R引物)序列:5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。熒光引物序列由上海普邁生物科技有限公司合成,SCA7、SCA8和SCA17基因正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記,SCA2基因引物采用熒光標(biāo)記M13末端加尾法標(biāo)記。SCA2基因正向引物(F引物)序列:5'?TTTGGTAGCAACGGCAAC?3',反向引物(R 引物 +M13引 物 ) 序 列 :5'?CACGACGTTGTAAAACGACCGGGCTTGCGGAATT?GG?3';SCA7基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?TTTTTTGTTACATTGTAGGAGCG?3',反向引物(R引物)序列:5'?AACCCACAGATTCCACGACT?3';SCA8基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3',反向引物(R 引 物 ) 序 列 :5'?TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG ?3';SCA17基因正向引物(F熒光引物)序列:5'?GGGACGTTGACTGCTGAAC?3',反向引物(R引物)序列:5?TTCTTCTTGCTTTCCACAGG?3'。PCR 反應(yīng)體系共 25 μl,依次加入 dNTPs 2.50 mmol,2× GC 緩沖液Ⅰ12.50 μl,SCA2、SCA7、SCA8 和 SCA17 基因正向引物和反向引物各5 pmol,模板DNA 100 ng,Taq酶1 U,加滅菌去離子水補充至25 μl。SCA2基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,以94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s循環(huán)35次,72℃延伸10 min;SCA7基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃ 50 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min,每個循環(huán)減1℃共循環(huán)15次,94 ℃ 50 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,共循環(huán)29次,72℃延伸10 min;SCA8基因PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃ 45 s、69℃ 30 s、72℃ 2 min,每個循環(huán)減0.50℃共循環(huán)20次,94℃45 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min,共循環(huán)10次,72 ℃延伸10 min;SCA17基因PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,循環(huán)35次,72 ℃延伸10 min。(2)瓊脂糖凝膠電泳:取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的瓊脂糖凝膠電泳,電壓100 V,電泳50 min,對于出現(xiàn)2條電泳條帶的樣品進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析。(3)基于毛細(xì)管電泳的片段分析:采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的CEQ?8000核酸分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段分析,包括 20 μl甲酰胺,以 0.25 μl CEQ DNA Size Standard Kit?600 片段作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo),1 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后上樣;預(yù)設(shè)程序進(jìn)行電泳分離,分離條件為毛細(xì)管溫度達(dá)50℃時,90℃變性120 s,電壓2 kV下注入樣本30 s、電壓4.80 kV下電泳70 min,以預(yù)設(shè)分析參數(shù)進(jìn)行片段分析。

    3.三核苷酸重復(fù)序列拷貝數(shù)計算 在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因及其包含的三核苷酸重復(fù)序列,在CEQ?8000核酸分析儀Analysis Parameters窗口STR Locus Tag界面設(shè)置重復(fù)次數(shù)與片段長度的對應(yīng)關(guān)系,以SCA17基因為例:正向引物經(jīng)D4熒光標(biāo)記,擴(kuò)增出287 bp片段,此片段包含38次CAG重復(fù)序列,因此設(shè)置CAG重復(fù)序列與片段長度的關(guān)系時,以287 bp對應(yīng)38次CAG重復(fù)序列為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)置。采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的GenomelabTMGeXP Genetic Analysis System軟件,以GS?600 LIZ片段為相對分子質(zhì)量標(biāo)記,計算樣本擴(kuò)增片段長度,并自動生成擴(kuò)增片段包含的重復(fù)序列。

    4.動態(tài)突變的克隆測序 將14例樣本送檢寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行克隆測序,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別切膠回收后,克隆至TaKaRa pMD?18?T載體,選取陽性克隆進(jìn)行DNA測序,計算CAG重復(fù)序列。

    結(jié) 果

    一、SCA2基因CAG重復(fù)序列分析

    對3例 SCA2型患者(編號:A15?71、A15?25和A16?9)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA2正常等位基因CAG重復(fù)序列為14~32次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為33~77次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為31、30和32次;毛細(xì)管電泳峰形特征為,大多數(shù)正常重復(fù)序列為單一銳利主峰,其右側(cè)有一矮峰,而擴(kuò)展重復(fù)序列為簇狀低矮爪形峰,CAG重復(fù)序列的計數(shù)以中間高峰為準(zhǔn)(圖1)。對3例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序,其結(jié)果顯示,CAG重復(fù)序列分別為37/40/40、37/38/39和38/39/40次;每例樣本的不同克隆測序結(jié)果CAG重復(fù)序列存在差異,且同一例樣本的不同克隆測序結(jié)果亦存在堿基差異。

    表1 SCA2、SCA7、SCA8和SCA17基因基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序結(jié)果Table 1. Results of expanded repeats numbers of SCA2,SCA7,SCA8 and SCA17 genes detected by capillary electrophoresis and clone sequencing

    二、SCA7基因CAG重復(fù)序列分析

    對2例SCA7型患者(編號:A20?13和 A20?13?2)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA7正常等位基因CAG重復(fù)序列為4~27次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為37~200次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,2例樣本擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為57和34次。對A20?13樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠回收克隆測序,第1次獲得的CAG重復(fù)序列為85次,第2次選取3個不同菌落進(jìn)行克隆測序,CAG重復(fù)序列分別為69、74和75次;對A20?13?2樣本擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行的克隆測序,CAG重復(fù)序列為45次。

    三、SCA8基因CTA/CTG重復(fù)序列分析

    對7例SCA8型患者的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA8正常等位基因重復(fù)序列為15~37次,異常等位基因重復(fù)序列>100次,某些個體攜帶中間重復(fù)等位基因?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為99、111、104、92、89、104和75次??寺y序顯示,7例樣本擴(kuò)展重復(fù)序列分別為97、116、104、90、90、102和76次。

    圖1 SCA2基因毛細(xì)管電泳峰形圖顯示,正常片段呈單一銳利主峰(黑箭頭所示),擴(kuò)展重復(fù)序列呈簇狀低矮爪形峰(紅箭頭所示)Figure 1 Capillary electrophoresis of SCA2 gene. Normal amplicon showed a single sharp main peak(black arrow indicates)and expanded repeats showed a cluster of low claw?shaped peak(red arrow indicates).

    四、SCA17基因CAG重復(fù)序列分析

    對2例SCA17型患者(編號:A20?33和A19?45)的樣本進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序(表1)。SCA17正常等位基因CAG重復(fù)序列25~42次,異常等位基因CAG重復(fù)序列為45~66次?;诿?xì)管電泳的片段分析顯示,2例樣本短片段/擴(kuò)展片段CAG重復(fù)序列分別為37/50和36/45次??寺y序顯示,A20?33樣本3個菌落短片段重復(fù)序列為37/36/36次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為51/50/52次,A19?45樣本2個菌落短片段重復(fù)序列為36/35次、擴(kuò)展片段重復(fù)序列為45/44次。

    討 論

    三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變是一種特殊的突變方式,多種疾病表現(xiàn)為患病后代的異常重復(fù)序列進(jìn)一步擴(kuò)展,導(dǎo)致發(fā)病年齡提前、疾病進(jìn)展加快,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和婚育。我們研究團(tuán)隊多年來致力于對此類突變患者進(jìn)行常規(guī)檢測,包括基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序,積累較為豐富的臨床經(jīng)驗。

    基于毛細(xì)管電泳的片段分析有以下幾方面特點:(1)穩(wěn)定性佳,如本研究SCA7基因A20?13樣本,我們研究團(tuán)隊曾對多個樣本進(jìn)行重復(fù)分析,結(jié)果完全一致。(2)存在問題,相關(guān)基因CAG重復(fù)區(qū)及其兩側(cè)GC含量升高,導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物遷移行為不同于堿基隨機(jī)組成的片段,毛細(xì)管電泳采用變性后的單鏈DNA,可以在電泳時產(chǎn)生“發(fā)卡”形二級結(jié)構(gòu),形成局部不完全堿基互補的雙鏈DNA,導(dǎo)致DNA鏈變短,如果以GC含量相對均衡的內(nèi)參照物作為對照,判讀的單鏈DNA長度小于 實 際 長 度[4?6]。 本 研 究 SCA2 和 SCA7 基 因CAG重復(fù)序列基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果均小于克隆測序結(jié)果。陳樸等[4]的研究顯示,SCA2和SCA7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高遷移率與其重復(fù)序列兩側(cè)GC含量升高密切相關(guān),究其原因可能是由于側(cè)翼GC含量升高可以增加單鏈DNA形成更加復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的機(jī)會,從而使DNA鏈進(jìn)一步縮短,對其遷移率產(chǎn)生更加顯著的影響。

    克隆測序有以下幾方面特點:(1)其優(yōu)點是可視性佳,直觀。(2)其缺點是步驟繁瑣;切膠時難以完全分開短片段和長片段;克隆過程中DNA復(fù)制忠實性較低,結(jié)果不穩(wěn)定。本研究對3例SCA2基因樣本行多個克隆測序,結(jié)果均不同,且出現(xiàn)多種堿基突變;對SCA7基因同一樣本的擴(kuò)展重復(fù)序列進(jìn)行2次切膠克隆測序,結(jié)果亦存在明顯差異。克隆測序結(jié)果的不穩(wěn)定性可能與大腸桿菌中序列異常重組有關(guān),使三核苷酸產(chǎn)生不穩(wěn)定性擴(kuò)增[7?9]。轉(zhuǎn)入大腸桿菌的重組雙鏈 DNA 在 CTG?CAG處發(fā)生DNA雙鏈斷裂,產(chǎn)生2個缺口,遂在斷裂缺口處以其他雙鏈DNA為模板,在大腸桿菌復(fù)制和修復(fù)功能作用下經(jīng)組合形成新的雙鏈DNA。與斷裂前相比,重新組合的雙鏈DNA CAG重復(fù)序列擴(kuò)展。在基因重組過程中,CAG重復(fù)序列越多、越易形成“發(fā)卡”形結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定 CAG 序列[7,10?13]。

    采用基于毛細(xì)管電泳的片段分析和克隆測序檢測SCA2和SCA7基因擴(kuò)展重復(fù)序列存在顯著差異,而SCA8和SCA17基因擴(kuò)展重復(fù)序列差異不顯著,究其原因,可能是由于SCA2和SCA7基因CAG重復(fù)序列較單純,在代間傳遞過程中易擴(kuò)展[14?15];SCA8和SCA17基因重復(fù)序列不單純,尤其是SCA17基因,重復(fù)序列包含多個胞嘧啶?腺嘌呤?腺嘌呤(CAA)序列,可能對重復(fù)序列具有穩(wěn)定作用[16?17]。

    通過長期的大量實驗和數(shù)據(jù)積累,我們認(rèn)為,基于毛細(xì)管電泳的片段分析是檢測基因動態(tài)突變的穩(wěn)定、可靠方法,在判讀重復(fù)序列時存在的差異是可以預(yù)知的,而且方法便于操作,適用于常規(guī)基因檢測。與此同時,我們結(jié)合家系患者的臨床表型特點和代間傳遞規(guī)律,對基于毛細(xì)管電泳的片段分析結(jié)果進(jìn)行判讀,以保證基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    近年來,基因測序技術(shù)發(fā)展迅速,但是目前應(yīng)用較為廣泛的二代基因測序由于讀長所限,難以對三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變進(jìn)行檢測。2013年,Loomis等[18]采用單分子實時測序(SMRT)首次獲得脆性X染色體綜合征(FRAX)基因三核苷酸重復(fù)序列的全長信息,為三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變的檢測提供新的技術(shù)。

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