黃芪總苷對阿霉素誘導損傷足細胞的保護作用*

宋元春，賽依帕，高 霞，羅 璇

甘肅省人民醫(yī)院兒科，甘肅 蘭州 730000

黃芪總苷(total astragalus glycosides，AST)是中藥黃芪有效提取成分之一，已有研究[1-4]表明黃芪總苷具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛、減輕心腦組織缺血再灌注損傷等多種藥理作用。

足細胞即腎小球臟層上皮細胞，具有抵抗腎小球內壓力、合成基底膜完整的各種成分和血管內皮生長因子，能維持腎小球毛細血管袢的空間結構及腎小球內皮細胞的功能完整性等功能[5]。足細胞是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病進展的關鍵細胞，其損傷是各種腎臟疾病進行性病變的基本特征[6]。

課題組前期研究采用阿霉素(ADR)對體外培養(yǎng)的足細胞進行模型構建，同時以黃芪總苷溶液對ADR誘導的足細胞損傷進行干預，發(fā)現(xiàn)黃芪總苷可維持ADR損傷的MPC5足細胞內氧化應激環(huán)境的平衡、改善遷移能力、抑制細胞骨架重排與破壞及抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮對損傷的MPC5足細胞的保護作用。但是其保護作用的具體分子機制尚不明確。因此，本實驗同樣采用ADR構建體外足細胞損傷模型并經不同濃度的黃芪總苷處理，觀察黃芪總苷對足細胞中基質金屬蛋白酶(MMPs)和凋亡相關蛋白表達的影響，探討黃芪總苷發(fā)揮保護作用的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠足細胞系(mouse podocyte clone 5，MPC5)購于美國 CHI Scientific公司；胎牛血清(美國Hyclone公司)；培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；鹽酸阿霉素(武漢鑫偉燁化工有限公司，注冊證號：H20130186)；黃芪總苷(上海晶都生物技術有限公司，純度≥98%)；Bax、Bcl-2、GAPDH、MT1、Nephrin 抗體及二抗(英國 Abcam 公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 足細胞的培養(yǎng) 將凍存的足細胞復蘇后，置于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合至70%左右進行傳代，分組處理。

1.2.2 實驗分組 將MPC5足細胞分為空白對照組(完全培養(yǎng)基)、ADR 損傷組(ADR 0.5 μmol/L)、低濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5 μmol/L+黃芪總苷50 μg/mL)、中濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5 μmol/L+黃芪總苷100μg/mL)及高濃度黃芪總苷治療組(ADR 0.5μmol/L+黃芪總苷200μg/mL)。各組分別處理24小時后進行實驗。

1.2.3 蛋白質印跡法(Western blot) 使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白并對蛋白質進行定量，每孔60 μg上樣，隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結束后將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜，封閉1～2小時，按1∶1 000比例加入相應兔抗小鼠多克隆抗體 Bcl-2、Bax、P53、MT1 及 Nephrin，4℃孵育24小時，用TBST洗1次，加入HRP標記的二抗(1∶5000)，室溫孵育2小時，TBST洗膜3次，5 min/ 次，最后采用ECL化學發(fā)光法及凝膠成像儀進行曝光，采用quantity one軟件測定蛋白灰度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測MMP-2和MMP-9 具體步驟嚴格按ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪總苷對ADR誘導的損傷足細胞MMPs蛋白質表達水平的影響 ADR可顯著下調MMP-2和MMP-9蛋白質表達水平(P＜0.05)；低、中、高濃度黃芪總苷均可上調ADR損傷組MMP-2和MMP-9蛋白質表達水平(P＜0.05)，見表1。

表1 各組足細胞MMP-2、MMP-9相對表達水平(±s) ng/mL

表1 各組足細胞MMP-2、MMP-9相對表達水平(±s) ng/mL

注：＊表示與空白對照組比較，P＜0.05；△表示與ADR損傷組比較，P＜0.05

組別 M M P-2 M M P-9空白對照組 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 A D R損傷組 0.4 4±0.0 5＊ 0.3 6±0.0 3＊低濃度黃芪總苷組 0.5 6±0.0 4＊Δ 0.5 2±0.0 2＊Δ中濃度黃芪總苷組 0.7 7±0.0 5＊Δ 0.8 0±0.0 3＊Δ高濃度黃芪總苷組 0.7 8±0.0 7＊Δ 0.7 3±0.0 3＊Δ

2.2 黃芪總苷對ADR誘導的損傷足細胞MT1、Nephrin及凋亡相關蛋白表達水平的影響 與空白對照組相比，ADR可顯著上調P53、Bax的表達水平(P＜0.05)，下調 Bcl-2、MT1、Nephrin 蛋白表達水平(P＜0.05)；與ADR損傷組相比，低濃度黃芪總苷組MPC5足細胞Bcl-2及MT1蛋白表達水平上調(P＜0.05)，而Bax、p53及Nephrin表達水平無明顯變化(P＞0.05)；與ADR損傷組比較，中、高濃度黃芪總苷干預的足細胞內Bax表達量明顯下降，Bcl-2、MT1表達量有所升高，中濃度黃芪總苷干預的足細胞內Nephrin表達量有所上調，中、高濃度黃芪總苷干預的足細胞內p53表達量均有所降低(P＜0.05)，見表 2，圖 1。

表2 各組足細胞相關蛋白相對表達量(±s)

表2 各組足細胞相關蛋白相對表達量(±s)

注：＊表示與空白對照組比較，P＜0.05；△表示與ADR損傷組比較，P＜0.05

組別 B a x B c l-2 M T 1 N e p h r i n p 5 3空白對照組 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 1.0 0±0.0 0 A D R損傷組 1.4 0±0.0 9＊ 0.5 1±0.0 3＊ 0.4 0±0.0 6＊ 0.6 2±0.0 1＊ 2.3 9±0.2 9＊低濃度黃芪總苷組 1.4 2±0.1 0＊ 0.7 3±0.0 4＊Δ 0.6 0±0.1 3＊Δ 0.6 5±0.0 5＊ 2.3 0±0.1 6＊中濃度黃芪總苷組 1.1 7±0.1 8 Δ 0.8±0.0 9＊Δ 1.0 5±0.1 8 Δ 0.7 2±0.0 5＊Δ 1.1 9±0.1 7 Δ高濃度黃芪總苷組 1.1 8±0.0 8 Δ 1.0 3±0.0 3 Δ 0.8 5±0.1 2 Δ 0.6 2±0.0 1＊ 1.4 8±0.2 4＊Δ

圖1 各組足細胞相關蛋白表達水平

3 討論

MMPs是一組同源的鋅、鈣依賴性內肽酶，主要分為6大類，MMP-2、MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶/明膠酶類[7]。在生理情況下，足細胞可分泌Ⅳ型膠原補充到腎小球基底膜上，維持多形性膠質母細胞(GBM)的正常新陳代謝。病理量的MMP-2、MMP-9會降解Ⅳ型膠原，不利于足細胞的黏附，繼而破壞GBM的完整性，促使腎間質纖維化[8-9]。我們前期研究結果表明ADR能嚴重破壞足細胞的細胞核及細胞骨架結構的完整性，還可增加足細胞遷移性能。這些改變不但可導致足細胞足突消失、細胞表型改變，還可誘導足細胞凋亡，并且足細胞從穩(wěn)定型轉為遷移型，最終導致足細胞脫落，破壞基底膜的完整性[10-11]。有研究[12-13]報道，ADR 對足細胞遷移能力的促進及細胞損傷可能與MMP-2、MMP-9的異常表達存在密切關系。本研究采用ELISA法檢測了各組MMP-2、MMP-9的表達水平，結果顯示，ADR可顯著降低MMP-2、MMP-9的表達水平，而黃芪總苷可上調MMP-2、MMP-9的表達水平。因此，黃芪總苷對ADR損傷的足細胞增殖能力及遷移能力的保護作用可能與改善MMP-2、MMP-9的異常表達有關。

p53可調節(jié)各種基因的表達，包括細胞凋亡，生長抑制及抑制細胞周期進程，分化和加速DNA修復等[14-15]。細胞凋亡途徑目前已公認的有3條：線粒體通路、死亡受體通路和內質網(wǎng)通路，其中前兩條凋亡通路均有p53蛋白的參與[16]。ADR誘導損傷足細胞p53蛋白表達水平顯著上調，黃芪總苷干預后p53表達水平有所下調，以100 μg/mL效果最佳。黃芪總苷對ADR誘導的損傷足細胞的保護作用極有可能與p53信號通路有關。ADR誘導的損傷足細胞促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2 蛋白表達水平明顯改變，100、200 μg/mL 濃度黃芪總苷對損傷足細胞Bax的上調和Bcl-2下調有顯著的抵御作用，提示黃芪總苷可能有抑制足細胞損傷加重及凋亡的作用。Nephrin表達的變化是足細胞損傷的主要標志物之一。有研究[17]證實，在阿霉素腎病大鼠模型中，Nephrin表達下調是蛋白尿產生的主要機制。本研究中100 μg/mL濃度黃芪總苷干預的足細胞nephrin表達較模型組上調。MT-1是足細胞特異表達的蛋白之一，對評價足細胞的活力和完整性有重要意義，在近端小管的表達強度明顯高于遠端小管和集合管[18]。本研究中MT-1表達水平在ADR誘導的損傷足細胞中顯著下調，而在100 μg/mL濃度的黃芪總苷干預的足細胞內有所上調。

綜上所述，黃芪總苷對ADR損傷的MPC5足細胞具有保護作用，這可能與黃芪總苷可以下調ADR損傷足細胞Bax、p53蛋白表達水平并上調MMP-2、MMP-9、MT1及Nephrin等蛋白表達水平有關。

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