獸藥殘留檢測中試劑盒的驗證方法研究

馬惠文

（煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東 煙臺 264003）

獸藥殘留是指在畜禽等食用動物使用藥物后，藥物發(fā)生蓄積，以藥物化學原型成分、分解中間體或雜質等形式，存在于動物的細胞、器官或者組織內部。這些物質對人的身體健康會產生非常嚴重的傷害或者引起病菌的耐藥性。因此，目前世界上許多國家對于動物性食品安全的主要評價手段就是通過獸藥殘留的檢測。但是，在應用試劑盒進行檢測過程中，發(fā)現(xiàn)有的檢測結果和試劑盒標注的各種技術指標存在較大差異，嚴重影響檢測人員對檢測結果的判定。因此，在采用試劑盒進行藥物殘留檢測之前對試劑盒各項技術指標進行嚴格的驗證，會大幅增加檢測人員對檢測結果判定的可信度。試劑盒的重要技術指標主要有試劑盒的標準曲線、檢測限、臨界值、定量限、精密度以及準確度等。

1 酶聯(lián)免疫的基本原理及特點

酶聯(lián)免疫吸附方法主要是將酶的高效催化作用和抗原-抗體免疫反應的特異性進行有機結合，因為酶的作用出現(xiàn)顏色反應，然后通過現(xiàn)代光學分析儀器對光度進行測定[1]。因此酶聯(lián)免疫吸附方法是一種非常靈敏和專屬的測試手段。

酶聯(lián)免疫吸附法的分類很多，按照其基本的反應原理主要可以分為間接法、抗體夾心法、捕獲法以及競爭法。在獸藥殘留檢測過程中經(jīng)常用的測定方法是競爭法，這種方法主要針對測定小分子化合物[2]。根據(jù)試驗的步驟不同可以分為間接法和直接競爭法兩種。該方法可以用來測定抗體也可以用來定量的測定抗原和半抗原[3]。比如以抗原為例，其主要過程就是將異性的抗體吸附在固相載體上，然后加入一定量酶標和待測抗原，二者相互之間競爭和固相抗體進行結合；然后經(jīng)過洗滌，加入底物溶液就可以產生顯色反應。酶標抗原和固相抗體發(fā)生充分結合，其分解的底物顏色很深。待測抗原量變多的時候，競爭性的產生抑制，阻礙了酶標抗原和固相抗體產生結合，因此固相抗體上的酶標抗原量就變少，顏色就變淺[4]。

酶聯(lián)免疫吸附法其特點也非常顯著，主要有以下幾個方面：反應的靈敏度非常高，因為酶的催化效率非常高，這就對于反應的效果起到了極大的推動作用，直接使得測定方法達到了非常高的敏感度；在檢測樣品的時數(shù)量非常大，因為其每個試劑盒都有96個孔，如果按照樣品和標準品都做平行計算的話，那么每個試劑盒一次性可以檢測42個樣品，這數(shù)量非?？捎^，有利于直接提高檢測的效率；檢測的流程變得比較簡單，一般情況下組織樣品前需要處理時間為2～3 h，利于試劑盒進行檢測的時間約為1.5 h，比如對于尿液樣品來說一般都是直接去清澈樣本直接進行試劑盒檢測需時約為1.5 h，這就直接使檢測流程變得簡單易操作，復雜性大幅降低；檢測限值比較低，比如沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅的檢測限值都在0.3～0.5 μg·kg-1，這對于防止出現(xiàn)假陰性樣品或者假陽性樣品起到了非常有效的積極作用，能夠很大程度上保障檢測結果的準確率[5]。

2 獸藥殘留檢測中ELISA的操作要點分析

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測結果是否可靠準確的前提保障就是穩(wěn)定的試劑盒、適宜的環(huán)境、成熟的方法。

2.1 試劑盒選擇及操作環(huán)境要求

試劑盒選擇必須選用經(jīng)過我國農業(yè)部備案的產品，對其質量要做好驗證工作，對同一種的檢測參數(shù)因為國內外出現(xiàn)的多種試劑盒也應通過檢測回收率進行多方面的驗證工作，這有利于保障試劑盒的效果和質量[6]。對于ELISA的操作環(huán)境也需要給予充分的關注，因為吸光度值受到溫度的影響很大，隨著溫度的升高，吸光度值也會隨著變大，這就可能出現(xiàn)假陽性。在檢測的時候應該注意對于操作環(huán)境的要求標準，由于很多試劑盒都是在2～8℃的環(huán)境中保存，因此在使用之前一定要讓試劑盒回溫到20～25℃[7]。另外在檢測前應該保證樣品溶液的溫度和標準溶液的溫度，一般情況下都是將樣品溶液和標準溶液放在同種溫度下大約30 min。有的時候需要在特定的環(huán)境下進行檢測，次數(shù)應該注意對于特定的溫度和時間在試驗的過程中不能隨便的改動，因為這都是試劑盒在研制過程中經(jīng)過很多次的試驗最后得到的優(yōu)化條件。

2.2 樣品前期處理

一般情況下，樣品在進行檢測之前都應該進行前期的處理，主要包括均質、提取、離心和濃縮以及溶解等操作步驟[8]。在均質的操作中一般都是要去除和檢測沒有關系的一些組成部分，比如在檢測“瘦肉精”的過程中，要除去脂肪的部分，只需提取肌肉部分。在進行組分提取的時候應該加入提取液，然后通過振蕩以及渦旋等方法，讓樣品和提取液進行充分的混合，這能夠有利于保障被測組分充分提取；在離心分離的時候也應該注意操作的時間和轉速要達到規(guī)定的要求標準，如果沒有達到標準的轉速和合適的離心時間就可能導致提取失敗。在離心和濃縮工作完成后，在有兩相以上的分離時應該保證目的相不能帶有其他的相，因為帶入其他相越多就會導致出現(xiàn)假陰性率和假陽性率更高[9]。

2.3 試劑盒檢測問題

對于要進行檢測的試劑盒應該保障其在使用的有效期范圍內，因不同的試劑盒反應的類型不同，而每個試劑盒都有不同的前期處理程序和操作程序，因此在檢測前期應該詳細閱讀其自帶的使用說明書，對于一些特別注意事項一定要給予更多的關注，比如試劑盒的保存條件，不同的試劑盒不可用混合使用等，保障檢測的操作程序符合要求的標準[10]。然后在加樣品的時候應該按照一定的順序進行，不能隨意顛倒順序，要保證加入的樣品時間是一致的，樣品的量也要準確，加入的時候應該注意不能加到孔壁的上部，應該加在孔底，不能濺出也不能產生氣泡。在加入樣品以后應該進行輕敲酶標板的四周，然后在桌面上進行圓周運動，這有利于保證進行充分的混勻。洗板也是非常重要的一個環(huán)節(jié)，雖然這不是反應試驗步驟，但也可以決定整個試驗的成敗，其目的主要就是洗去反應液中沒有和抗體或者固相抗原結合的物質，并在反應過程中吸附在固相載體上的一些干擾的物質，如果洗滌不夠徹底的時候，就可能導致有酶結合物的非特異性吸附，使得空白值增大很多。比如在進行孵育的時候一般都是要求在一定的溫度下進行，為了防止溶劑的蒸發(fā)，就需要搞清楚試驗示范需要避光孵育。而且在加入終止液以后隨著時間的推移可能使得OD值變低，因此很多試劑盒都規(guī)定了在加入終止液后的讀數(shù)有效時間范圍[11]。

2.4 結果判斷

因為酶聯(lián)免疫吸附法在獸藥殘留檢測過程中主要是用來進行篩選，其判定的標準有以下幾個方面：現(xiàn)有的標準，采用方法的檢測限作為判定的依據(jù)和標準；對于沒有標準的，應該采用其他檢測方法的檢測限作為判定的標準，比如采用這種方法篩選出陽性樣品通過確認的方法進行驗證；應該添加陽性的質控樣作為對比，這有利于排除基質效應的干擾[12]。

3 標準曲線

3.1 定量的驗證方法

試劑盒中應含有不同濃度的標準溶液，使標準曲線至少有5個不同的濃度點，每個濃度測定次數(shù)不應低于5次；確定工作濃度范圍和最大殘留限量都在允許的范圍內。IC50就是指抑制濃度為50%，也就是0濃度的標準溶液的吸光度值在50%的時候對應的藥物濃度，這主要是反映了試劑盒的靈敏度。工作濃度范圍主要是指樣品中的藥物濃度范圍。

3.2 定性的驗證方法

工作濃度范圍主要是由陽性樣品、臨界值濃度樣品以及陰性樣品進行測定最終得到的，對于每個濃度都應重復進行測定，次數(shù)應≥5次。濃度和響應值之間存在著正比例或者反比例的關系[13]。

4 定量限和檢測限

定量限應大于圖1標準曲線中的最低濃度點，根據(jù)試劑盒標注的檢測方法進行相關測定。測定次數(shù)≥6次，最終的檢測值應和試劑盒上的定量限制進行比較，而且還應注意不能通過外延的方法進行推理判斷。首先稱取20份空白樣品，然后將空白樣品根據(jù)試劑盒提供的檢測方法來進行測定，將測定結果進行計算得到平均值，加3倍的標準差，就得到該試劑盒的檢測限。應注意該試劑盒提供的檢測限是否和得到的檢測限相符[14]。

5 臨界值

對于一些殘留限量非常高的藥物，常用的檢測方法就是其臨界值一般為20份樣品添加MRL濃度，重復測定3次，計算平均值，然后減去1.64的標準差得到，也就是95%置信限出值。對于公認的一些禁用藥物進行檢測，應用臨界值作為定量限，得到的值應達到本實驗室操作的檢測標準，否則認為不合格[15]。

6 交叉反應

交叉反應主要是指兩種不同的抗原分子但相互之間具有相同的部分或者類似結構的抗原表位，彼此發(fā)生的反應。比如，一種藥物B的反應率為100%，分別測定了其他各種藥物的50%抑制濃度，那么就可以得到其公式為：

7 準確度和精密度

準確度主要用回收率來表示，回收率一般要＞40%或者試劑盒上標注的回收率數(shù)值。而精密度主要是通過變異系數(shù)來表示，按照前期預定數(shù)量的要求進行檢測，然后計算出結果。對于禁用的藥物其變異系數(shù)應該滿足≤30%。對于每個平行樣之間的變異系數(shù)應該滿足≤25%。

8 保存期

保存期是依據(jù)保存條件通過穩(wěn)定性試驗結果最終確定的。一般情況下正常條件的保存都應該在0、1、2、3個月進行測定。然后可以依據(jù)保存期，在后期每間隔3個月進行1次測定。在此推薦考慮進行37℃的凍融和加速穩(wěn)定性方面的試驗。

9 小 結

總之，通過試驗進行方法學檢驗后，對于試劑盒所標注的各項技術指標有了明確的評判標準，能夠評判試劑盒是否真的能夠滿足國家有關標準的要求。如果實際檢測結果和試劑盒標示的各項技術指標都是在允許的差值范圍內，并能夠達到國家相關標準要求，該試劑盒是合格產品，可以用來進行藥物殘留的檢測驗證。反之，如果檢測的結果和試劑盒標示的各項指標超過了允許的差值范圍，則可以評判該試劑盒不合格，不能用來進行藥物的殘留檢測[16-19]。

[參考文獻]

[1] 何丹.氨芐青霉素殘留ELISA檢測方法的建立及檢測條件優(yōu)化[D].杭州:浙江大學,2004.

[2] 楊揚.青霉素類藥物殘留ELISA檢測方法研究[D].杭州:浙江大學,2006.

[3] 王麗娜,郝利忠,韓春曉,等.獸藥殘留檢測中酶聯(lián)免疫試劑盒的選擇原則與使用注意事項[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013（7）:41-44.

[4] 沈亞安.多西環(huán)素間接競爭ELISA檢測方法的建立[D].武漢:華中農業(yè)大學,2010.

[5] 劉智宏,葉妮,郭文林,等.四環(huán)素類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法[J].中國農業(yè)科學,2009,42（1）:318-323.

[6] 劉百紅.磺胺類藥物殘留ELISA快速檢測試劑盒的研制[D].武漢:華中農業(yè)大學,2006.

[7] 王麗英.己烷雌酚抗體的制備與ELISA方法的建立[D].無錫:江南大學,2007.

[8] 田博,金堅,惠人杰,等.獸藥殘留檢測中磺胺嘧啶ELISA試劑盒的研制[J].生物加工過程,2017,15（1）:69-72.

[9] 呂珍珍,蔣小玲,劉金釧,等.免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用[J].農產品質量與安全,2012（9）:76-79.

[10] 徐偉,程鳳科,孟銀,等.酶聯(lián)免疫吸附法在獸藥殘留檢測中的應用[J].中國家禽,2013,35（12）:49-50,52.

[11] 郭明星,羅志萍,余純.獸藥殘留免疫檢測質量控制研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2004（10）:14-16.

[12] 馮才偉,朱君紅,王會玲,等.酶聯(lián)免疫法測定豬肉中磺胺類藥物的殘留[J].四川畜牧獸醫(yī),2012,39（2）:27-29.

[13] 伏慧明,郭展旗,王翠英,等.獸藥殘留檢測中試劑盒的驗證評判方法研究[J].中國農業(yè)科技導報,2008,10（2）:109-111.

[14] 蔣建云,楊學文.酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測飼料中黃曲霉毒素B1[J].江西飼料,2006（6）:18-19.

[15] 陳志瑩,張新濱,趙藝,等.試劑盒法檢測獸藥殘留應注意的問題[J].中國禽業(yè)導刊,2008,25（11）:41.

[16] 孫志文,羅曉琴,張德紅,等.我國獸藥殘留檢測試劑盒市場的規(guī)范化管理[J].獸醫(yī)導刊,2005（11）:40-41.

[17] 劉維紅.酶聯(lián)免疫吸附法在畜產品獸藥殘留檢測中的應用[J].山東畜牧獸醫(yī),2017,38（4）:61-62.

[18] 丁雪嬌,楊瑩,楊成竹,等.淺析選擇獸藥殘留ELISA試劑盒的幾個注意事項[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2016（2）:76-77.

[19] 張新濱,陳志瑩,朱增娟,等.運用試劑盒法檢測獸藥殘留[J].新農業(yè),2009（12）:42-43.