系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腸道微生物與抗dsDNA抗體水平的相關(guān)性

鄒桂香，段新旺*，牛海濤

(1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，南昌 330006； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE，簡稱狼瘡)，是以抗核抗體為代表的多種致病性自身抗體增加、免疫復(fù)合物異常沉積及免疫細胞功能失調(diào)而引起的一種慢性多器官損害的自身免疫性疾病。作為一種具有代表性的系統(tǒng)性的自身免疫性結(jié)締組織病,發(fā)病具有明顯的性別差異,男女比例大體上為1∶9[1]。雖然國際上對狼瘡的研究很多，但確切的發(fā)病機制仍不清楚[2]。研究普遍認為其發(fā)病機制與基因遺傳、免疫失調(diào)、激素及環(huán)境等多種因素相關(guān)[3]。狼瘡是一種多基因易感性疾病，有明顯的家系聚集性。相關(guān)研究中報道，狼瘡患者中同卵雙胞胎共同患病率為24%～57%，遠高于異卵雙胞胎共同患病率的2%[4-5]。所以同卵雙胞胎中有一方發(fā)病，另一方的不發(fā)病的概率也有40%以上，環(huán)境因素可能起到了重要作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型B6.NZMSle1/2/3(TC小鼠)是一種是由C57BL/6 J小鼠與狼瘡NZM2410小鼠雜交后建立的、同時攜帶三種狼瘡易感基因(Sle1/Sle2/Sle3)的純合遺傳性自發(fā)狼瘡小鼠，該模型可模擬人類狼瘡的自身免疫特征，其發(fā)病主要特征表現(xiàn)為抗dsDNA陽性[6]。然而我們的研究發(fā)現(xiàn)雖然TC小鼠基因型完全相同，但有很少一部分雌鼠不發(fā)病，表現(xiàn)為抗dsDNA陰性，該部分雌鼠不發(fā)病的原因至今未明。相關(guān)研究提示，基因遺傳因素雖然在狼瘡的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但環(huán)境因素也與狼瘡的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。我們推測腸道微生物作為環(huán)境因素的重要組成部分，與TC小鼠的dsDNA水平相關(guān)。相關(guān)報道，狼瘡發(fā)病的危險因素包括：使用抗生素、寄生蟲藥物或胃腸道疾病相關(guān)藥物等[8]。上述危險因素提示腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與狼瘡發(fā)病高度相關(guān)。

腸道微生物菌群參與了人體的代謝、營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)功能[9-10]。通過與相鄰的腸道黏膜環(huán)境直接相互作用，腸道微生物菌群可影響腸道黏膜的通透性，進而參與局部和全身的免疫炎癥活動[11]。越來越多的證據(jù)表明，胃腸道中的微生物菌群影響嚙齒動物模型中自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。

本研究通過檢測同周齡TC雌鼠的抗dsDNA抗體，比較dsDNA陽性組與dsDNA陰性組的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)差異，探討狼瘡TC小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與抗dsDNA抗體的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

TC小鼠為純合狼瘡小鼠(B6.NZMSle1/2/3)，由美國佛羅里達大學(xué)Morel Laurence教授實驗室贈送并在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所SPF3級動物房飼養(yǎng)及繁殖【SYXK(京)2015-0035】，在飼養(yǎng)及繁殖期間，使用小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲用水(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供)。飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度40%～70%，溫度20～ 26℃，晝夜交替各半。所有實驗操作符合實驗動物倫理要求(倫理審批號：ILAS— FG-2015-016)。

1.1.2 試劑材料

ELISA法檢測抗dsDNA抗體實驗的相關(guān)試劑：包被抗原dsDNA，購于Sigma公司；標(biāo)記抗體Goat Anti-Mouse IgG，購于Southern Biotech公司；酶底物顯色劑Phosphatase substrate, 購于Sigma公司。小鼠糞便DNA提取試劑盒，購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗dsDNA抗體檢測

30周齡TC雌性小鼠35只，體重25～30 g，臉頰采血后離心，取血清。ELISA檢測血清中抗dsDNA抗體，具體操作步驟參考文獻[13]。

1.2.2 小鼠糞便收集

無菌環(huán)境下收集TC小鼠的新鮮糞便，每份標(biāo)本糞便均不少于3粒，快速置于滅菌離心管中，-80℃保存。

1.2.3 DNA提取和測序

按照說明書，使用糞便DNA提取試劑盒對小鼠糞便樣本中的微生物總DNA進行提取；利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，將基因組DNA樣品稀釋至1 ng/μL作為模板，針對細菌的16S rRNA基因高變區(qū)V3～V4區(qū)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物檢驗合格后，通過混樣、建庫及文庫質(zhì)控，將檢測合格的文庫進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)方析

將原始序列進行堿基去除過濾，再去除嵌合體序列得到最終有效的序列。根據(jù)最終有效序列的相似性對微生物菌群進行聚類，相似性為97%的序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。采用OTUs聚類分析及物種注釋、多樣性指數(shù)分析及組間差異物種分析等對兩組TC小鼠微生物菌群進行生物學(xué)信息分析。

注：不同顏色代表不同的菌門。圖2 組間門水平相對豐度結(jié)構(gòu)對比圖Note. Different color represents different phyla.Fig.2 Relative abundance of the gut microbiota between groups at phylum level

微生物菌群數(shù)據(jù)采用Qiime軟件計算Shannon，Simpson指數(shù)及UniFrac距離并采用R軟件(Version 2.15.3)進行Alpha多樣性指數(shù)及Beta多樣性指數(shù)組間差異分析，進行t檢驗，及作圖。血清檢測抗體數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件進行t檢驗。所有數(shù)據(jù)均以P<0.05為差異有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 抗dsDNA抗體檢測

TC小鼠的dsDNA檢測結(jié)果如圖1所示：同齡TC小鼠多數(shù)為dsDNA陽性(dsDNA-pos.),然而很少部分TC小鼠為dsDNA陰性(dsDNA-neg.)。

注：dsDNA陽性的TC小鼠(n=30)； dsDNA陰性的TC小鼠(n=5)；****P<0.0001。圖1 TC小鼠dsDNA濃度Note. dsDNA-positive lupus TC mice (n=30); dsDNA-negative lupus TC mice (n=5).****P<0.0001.Fig.1 dsDNA concentration in the TC mice

2.2 腸道微生物菌群生物學(xué)信息分析

2.2.1 腸道微生物物種豐度分析

為了解兩組樣本的物種豐度含量，根據(jù)不同分類水平的物種注釋及豐度信息，選取兩組在門水平上平均豐度排名前10的物種，根據(jù)其在每組中的豐度信息，得到門水平上物種相對豐度柱形圖，可直觀查看每組樣本在門水平上相對豐度較高的物種及其比例。兩組組間門水平相對豐度信息如圖2所示：dsDNA陽性組TC小鼠Firmicutes(厚壁菌門)的物種豐度含量高于dsDNA陰性組，dsDNA陽性組TC小鼠Bacteroidetes(擬桿菌門)的物種豐度含量低于dsDNA陰性組，提示厚壁菌門與擬桿菌門和TC小鼠dsDNA水平有一定相關(guān)性。

2.2.2 腸道微生物菌群多樣性比較分析

腸道微生物菌群多樣性可用Alpha多樣性指數(shù)和Beta多樣性指數(shù)進行分析。通過Alpha多樣性指數(shù)分析，本研究未發(fā)現(xiàn)dsDNA陽性與dsDNA陰性組TC小鼠組間物種多樣性均值差異有顯著性。

Beta多樣性是對微生物群落構(gòu)成的比較分析,評估不同組樣本微生物群落的差異。如圖3所示：利用OTUs的豐度信息構(gòu)建UniFrac距離(Unweighted UniFrac，Beta多樣性指標(biāo)之一)，通過t檢驗，dsDNA陽性組的物種群落多樣性顯著低于dsDNA陰性組TC小鼠(P<0.05)。提示TC小鼠的微生物菌群多樣性與抗dsDNA抗體水平相關(guān)。

圖3 Beta多樣性組間差異箱形圖Fig.3 Box graph of the β-diversity of group differences

2.2.3 腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組間差異物種分析

通過在門、綱、目、科、屬水平上對兩組測序樣本進行比較分析，發(fā)現(xiàn)dsDNA陽性組與dsDNA陰性組TC小鼠分別在門水平的Chloroflexi(綠彎菌門)；綱水平的Betaproteobacteria(β變形菌綱)、Deltaproteobacteria(δ變形菌綱)和Ktedonobacteria(纖線桿菌綱)；目水平的Burkholderiales(伯克氏菌目)、Desulfovibrionales(脫硫弧菌目)和Ktedonobacterales(纖線桿菌目)；科水平的Alcaligenaceae(產(chǎn)堿菌科)和Desulfovibrionaceae(脫硫弧菌科)；屬水平Parasutterella(副薩特氏菌屬)、Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)上差異均有顯著性(圖4)，提示TC小鼠的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)可能與抗dsDNA抗體水平相關(guān)。

3 討論

3.1 腸道微生物菌群多樣性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系

相關(guān)研究分析，腸道微生物菌群整體多樣性降低將增加自身免疫性疾病的風(fēng)險[14]。本研究發(fā)現(xiàn)dsDNA陽性的TC小鼠和dsDNA陰性的TC小鼠之間在Beta多樣性指數(shù)中差異有顯著性，且dsDNA陽性組TC小鼠的Unweighted UniFrac數(shù)值顯著低于dsDNA陰性組，說明dsDNA陽性組的腸道微生物菌群多樣性指數(shù)降低可能與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病相關(guān)，提示腸道微生物菌群多樣性降低與狼瘡抗dsDNA抗體水平相關(guān)。

3.2 腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系

本研究腸道微生物菌群的門、綱、目、科、屬不同物種分類水平中，既有益生菌如乳桿菌，也有與宿主共存的機會致病菌如大腸桿菌，還有致病菌如金葡菌等。且dsDNA陽性組與陰性組TC小鼠在腸道微生物菌群的各個分類水平差異均有顯著性，提示腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與狼瘡抗dsDNA抗體水平相關(guān)。

注：橙色表示dsDNA陽性組TC小鼠，藍色表示dsDNA陰性組TC小鼠。A圖，左側(cè)表示綠彎菌門水平；B圖，左側(cè)表示β變形菌綱、δ變形菌綱和纖線桿菌綱水平；C圖，左側(cè)表示伯克氏菌目、脫硫弧菌目和纖線桿菌目水平；D圖，左側(cè)表示產(chǎn)堿菌科和脫硫弧菌科水平；E圖，左側(cè)表示副薩特氏菌屬和脫硫弧菌屬水平；所有A、B、C、D、E圖，右側(cè)均為該圖左側(cè)物種在兩組組間差異的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果P值，P<0.05為差異具有顯著性。圖4 門、綱、目、科、屬水平組間差異物種對比圖Note. Orange indicates dsDNA positive TC mice and blue indicates dsDNA negative TC mice. The left side of Panel A shows the level of Chloroflexi. The left side of Panel B shows the levels of Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, and Ktedonobacteria. The left side of Panel C shows the levels of Burkholderiales and Desulfovibrionales. The left side of Panel D shows the levels of Alcaligenaceae and Desulfovibrionaceae. The left side of Panel E shows levels of Parasutterella and Desulfovibrio. All of the right side of Panels A, B, C, D, E are P value of statistical analysis between the two groups. Significant difference was shown as P<0.05.Fig.4 Comparison chart of differential species of gut microbiota between the groups at phylum, class, order, family, and genus levels

腸道微生物菌群中厚壁菌門和擬桿菌門在本研究中兩組占90%以上，屬于優(yōu)勢菌群。厚壁菌門和擬桿菌門的比例被稱為F/B比率，可作為評估腸道微生物菌群失調(diào)的生物標(biāo)志物[15]，且F/B比率被認為與人類腸道微生物菌群成分有顯著的相關(guān)性[16]。有文獻報道，狼瘡患者，其腸道微生物菌群F/B比率低于健康人[17]。但有另外文獻報道，高血壓和肥胖患者腸道微生物菌群F/B比率高于健康人[18-19]。盡管腸道微生物菌群F/B比率被認為是腸道微生物菌群紊亂的標(biāo)志，但F/B比率的升高或降低與疾病的相關(guān)性仍存在很大爭議。本研究dsDNA陽性組TC小鼠的F/B比率高于dsDNA陰性組，與人類狼瘡報道的F/B比率低于健康人群差異較大，可能與TC小鼠的狼瘡易感基因相關(guān)，有待進一步深入研究。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡小鼠病情的嚴重程度與腸道中乳酸桿菌的消耗和毛螺菌的增加有一定相關(guān)性[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)Lachnospiraceae_NK4A136_group(毛螺菌)在dsDNA陽性組TC小鼠含量高于dsDNA陰性組, 提示毛螺菌的增加與抗dsDNA水平正相關(guān)。Proteobacteria(變形菌門)在兩組中含量在1.2%～1.6%左右，在該菌門下，dsDNA陽性組與dsDNA陰性組TC小鼠在屬水平副薩特氏菌屬和脫硫弧菌屬差異具有顯著性。變形菌門大多數(shù)都是致病菌，雖然在腸道微生物菌群中內(nèi)含量較少，但是本研究中兩種差異具有顯著性的菌屬均屬于變形菌門，提示變形菌門在狼瘡的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。本研究的結(jié)果為進一步深入研究腸道微生物菌群與狼瘡發(fā)病機制的關(guān)系提供了依據(jù)。

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