泮托拉唑?qū)ξ赴┘?xì)胞MKN-45增殖與凋亡的影響

王鳳記，盧艷君，程相欽

山東省寄生蟲病防治研究所（山東省消化系統(tǒng)疾病防治中心）普外科，山東 濟(jì)寧 272033

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位居全國惡性腫瘤的第2位和第3位，且均呈逐年上升趨勢[1-2]。質(zhì)子泵抑制劑（ptoton pump inhibitors，PPI）作為一種抑酸藥物，通過Vaculor H+-ATPase或H+/K+-ATPase，通過胃壁細(xì)胞，進(jìn)入小管腔聚集發(fā)揮作用，常常用于酸性疾病的治療，如胃潰瘍、消化道出血、胃癌等[3-6]。泮托拉唑作為第三代PPI，不僅對酸具有穩(wěn)定性，還有著良好的靶位專一性，比第二代PPI的生物利用度提高了7倍，而且不影響其他藥物在肝臟中的代謝，因此被廣泛地應(yīng)用于多種酸性疾病的治療當(dāng)中，如能夠降低胃潰瘍發(fā)病率，對消化道出血療效顯著[7-8]。另外，相關(guān)研究還顯示泮托拉唑能顯著誘導(dǎo)SMCC-7721肝癌細(xì)胞凋亡，抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞及SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖[9-11]。但泮托拉唑?qū)τ谖赴┘?xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用機(jī)制報道較少，因此本研究將對此展開探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

胃癌細(xì)胞MKN-45購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器

泮托拉唑購自杭州中美華東制藥有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH單克隆抗體均購自美國宜百康公司；四甲基偶氮唑鹽（methye thiazolye telrazlium，MTT）、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Hoechst染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；DMI4000B倒置熒光顯微鏡購自德國萊卡公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀、DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測MKN-45細(xì)胞活力 將5×103個MKN-45細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細(xì)胞48 h，加入20 μl的MTT孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，在酶標(biāo)儀波長560 nm處測光密度（optical density，OD）值。每組平行3個復(fù)孔。

1.3.2 Hoechst染色檢測MKN-45細(xì)胞形態(tài) 將8×103個MKN-45細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細(xì)胞48 h，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定，Hoechst染色液染色5 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡的細(xì)胞熒光更強(qiáng)，細(xì)胞核發(fā)白，呈現(xiàn)皺染。每組平行3個復(fù)孔。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將8×103個MKN-45細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細(xì)胞48 h，收集1×105/ml個細(xì)胞，加入5μl的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）并吹打均勻，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測分析。

1.3.4 Western blot檢測細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E蛋白的表達(dá) 將8×103個MKN-45細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液（兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100）孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1～2h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，多組間比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞活力的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細(xì)胞48 h后，四組MKN-45細(xì)胞活力分別為（0.78±0.08）、（0.64±0.07）、（0.50±0.05）、（0.37±0.04），四組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.383，P=0.000）；且與 0 μg/ml比較，10、20、40 μg/ml泮托拉唑作用后MKN-45細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖1）

圖1 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞活力的影響

2.2 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞凋亡的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45細(xì)胞48 h后，經(jīng)Hoechst染色實驗發(fā)現(xiàn)，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能使細(xì)胞核發(fā)白，呈現(xiàn)皺染。（圖2）

圖2 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst染色，×200）

2.3 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞周期的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45細(xì)胞48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能逐漸使細(xì)胞周期阻滯在G1期，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后，G1期 MKN-45 細(xì)胞比例較0 μg/ml增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞周期的影響（%，±s）

表1 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞周期的影響（%，±s）

注：*與0 μg/ml泮托拉唑比較，P<0.01

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2.4 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細(xì)胞48 h后，與 0 μg/ml比較，20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后MKN-45細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)，Bax表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖3、表2）

圖3 Western blot檢測泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

表2 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)的影響（±s）

表2 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)的影響（±s）

注：與0 μg/ml泮托拉唑比較，*P<0.01

泮托拉唑濃度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Bax/GAPDH 0.18±0.02 0.19±0.02 0.38±0.04*1.13±0.11*10.28 0.002 Bcl-2/GAPDH 0.94±0.09 0.93±0.09*0.42±0.04*0.28±0.03*25.55 0.000

2.5 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Cyclin D1及Cyclin E表達(dá)的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細(xì)胞48 h后，與0 μg/ml比較，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明顯下調(diào)Cyclin D1及Cyclin E表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖4、表3）

圖4 Western blot檢測泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Cyclin D1及Cyclin E表達(dá)的影響

表3 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Cyclin D 1及Cyclin E表達(dá)的影響（±s）

表3 泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Cyclin D 1及Cyclin E表達(dá)的影響（±s）

注：與0 μg/ml泮托拉唑比較，*P<0.01

泮托拉唑濃度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Cyclin D1/GAPDH 0.92±0.09 0.29±0.02*0.16±0.01*0.05±0.00*38.45 0.000 Cyclin E/GAPDH 0.97±0.09 0.31±0.03*0.22±0.02*0.05±0.00*42.13 0.000

3 討論

pH值對于細(xì)胞各種生理功能的發(fā)揮至關(guān)重要，參與H+跨膜運輸?shù)馁|(zhì)子泵包括H+/K+，H+/Na+，V-ATPase等，而在真核細(xì)胞膜上起著重要作用的是V-ATPase。V-ATPase在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，抑制酵解所產(chǎn)生的乳酸在細(xì)胞內(nèi)的聚集，繼而使腫瘤細(xì)胞避免了凋亡的命運[3-6]。而作為V-ATPase抑制劑，PPI能夠在pH﹤4的酸性環(huán)境中發(fā)揮抑酸作用，被廣泛地應(yīng)用于酸性疾病的治療，且療效及安全性均得到肯定[3-6]。已有研究證實，作為第三代PPI泮托拉唑已被廣泛應(yīng)用于酸性疾病的治療當(dāng)中，包括胃癌[7-8]。因此，本研究以泮托拉唑為研究對象，探討泮托拉唑?qū)ξ赴┘?xì)胞MKN-45增殖與凋亡的影響。

癌細(xì)胞的過度增殖、凋亡受限制是胃癌發(fā)生的重要原因[12-14]，因此，本研究首先參考相關(guān)文獻(xiàn)并利用MTT法檢測不同濃度的泮托拉唑?qū)KN-45胃癌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明顯降低MKN-45細(xì)胞活力（P﹤0.01），與以往學(xué)者研究報道一致[11]。接著利用Hoechst染色檢測泮托拉唑?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明泮托拉唑能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期G1、S、G2期是細(xì)胞周期的主要調(diào)控點，也是眾多抗腫瘤藥物作用的主要靶點，特別是G1期。G1期是決定細(xì)胞是否能夠進(jìn)入S期，是否能夠正常進(jìn)行DNA復(fù)制及是否能夠進(jìn)行有絲分裂的前提[15-16]。所以本研究繼續(xù)利用流式雙染技術(shù)檢測泮托拉唑?qū)KN-45胃癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明泮托拉唑能使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而說明泮托拉唑能通過阻滯細(xì)胞周期抑制MKN-45細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

胃癌的發(fā)生機(jī)制與眾多腫瘤類似，涉及細(xì)胞凋亡基因的異常和細(xì)胞周期的紊亂等[12-13]。細(xì)胞凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，Bcl-2家族是研究最為廣泛的細(xì)胞凋亡調(diào)控家族。其中抑凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，促進(jìn)細(xì)胞的存活與生長[17]。而Bax還能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞到Caspase家族，使信號放大，最后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Cyclin D1、Cyclin E是與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，Cyclin D1在生長因子等刺激下，與細(xì)胞周期依賴性蛋白4/6（CDK4/6）形成復(fù)合物，促進(jìn)Rb磷酸化，并使轉(zhuǎn)錄因子E2F進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控細(xì)胞靶基因轉(zhuǎn)錄，推動DNA復(fù)制所需蛋白質(zhì)的合成[19]。而在Cyclin D1被降解后，Cyclin E與CDK2形成復(fù)合物，代替Cyclin D1發(fā)揮作用，促使G1期向S期轉(zhuǎn)變，推動細(xì)胞周期向DNA復(fù)制發(fā)展[20]。因此，本研究繼續(xù)利用Western blot檢測泮托拉唑?qū)KN-45細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E表達(dá)的影響，結(jié)果表明泮托拉唑能明顯下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)（P﹤0.01），從而阻滯細(xì)胞周期于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能明顯降低MKN-45胃癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，此過程可能是通過下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)實現(xiàn)的。

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