維生素D3與雌性生殖

徐 歡， 何琳琳

(1.陜西理工大學 維生素D生理與應用研究所， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000)

維生素D(vitamin D，VD)是一種人體必需的脂溶性維生素，屬于類固醇衍生物。VD家族成員中與人類密切相關的是VD2和VD3，VD2主要存在于部分植物和真菌中，以食物的形式被人體吸收。維生素D3(vitamin D3，VD3)主要通過皮膚產(chǎn)生，與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結合后發(fā)揮其生物學作用。VD3的經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷代謝平衡和維持骨的健康，目前VD3的作用已延伸至雌性生殖系統(tǒng)[1]。近年來由于VD3缺乏導致的不孕女性逐年增多，促使對VD3和雌性生殖的研究不斷深入。VD3經(jīng)維生素D代謝酶即維生素D合成酶和降解酶催化可產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，其中1,25(OH)2D3(1,25D3)是VD3在動物體內(nèi)的活性形式，主要通過VDR發(fā)揮其生物學作用[2]。VDR和維生素D代謝酶廣泛分布于雌性生殖系統(tǒng)，表明VD3參與調(diào)節(jié)雌性生殖。目前對于VD3/VDR在雌性生殖系統(tǒng)中的功能研究較少，主要集中在對卵泡生成比較重要的雌性激素的產(chǎn)生和分泌的調(diào)控部分。本文主要討論大鼠、小鼠、人雌性生殖系統(tǒng)中VDR和維生素D代謝酶的表達和分布、VD3與雌性生殖的相關性及其分子機制，以期為推進VD3影響雌性生殖的分子機制和臨床治療女性生殖相關疾病的研究提供理論依據(jù)。

1 VD3的代謝和作用機制

人體中VD3主要通過皮膚產(chǎn)生，極少部分通過食物吸收。當人體皮膚暴露在陽光紫外線下時，皮膚中的7-脫氫膽固醇轉變?yōu)閂D3前體，在肝臟細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中經(jīng)25-羥化酶作用生成25OHD3(25D3)。25D3通過血液轉運至腎，經(jīng)1α-羥化酶作用生成活性VD3即1,25D3，其中部分1,25D3和少數(shù)25D3分別經(jīng)腎臟中的24-羥化酶轉化成1α，24，25(OH)2D3和24，25(OH)2D3。25-羥化酶和1α-羥化酶為維生素D合成酶，25-羥化酶主要由CYP2R1和CYP27A1編碼，1α-羥化酶主要由CYP27B1編碼，主要參與活性VD3的合成。CYP27A1除催化產(chǎn)生主要代謝物25D3外，還產(chǎn)生至少7種形式的次要代謝物，而CYP27B1似乎只催化25D3的C-1α位置的羥基化反應[3]。24-羥化酶是維生素D分解酶，主要由CYP24A1編碼，它除了能使1,25D3和25D3的24位羥基化，還可將VD3代謝為VD3-23羧酸(calcitroic acid)后經(jīng)膽汁由糞便排出[4]。

VD3在機體中的反應非常復雜，其發(fā)揮作用不僅受VD3攝入量的影響，還受VD3代謝酶和VDR是否表達以及表達水平高低的影響[5]。VD3代謝酶合成的1,25D3主要通過VDR發(fā)揮其生物學作用，VDR屬于配體依賴性轉錄因子超家族，VD3與VDR結合后，VD3/VDR與核受體視黃酸X受體(Retinoid-X-Receptor，RXR)相互作用形成VD3/VDR/RXR復合物，復合物結合靶基因的維生素D應答元件(vitamin D response element，VDRE)，激活或抑制靶基因的轉錄表達，從而實現(xiàn)VD3的基因組作用[2]。而VD3的非基因組作用主要是指其激活信號分子以及伴隨著蛋白激酶快速產(chǎn)生第二信使，也包括Ca2+和Cl-通道的開放[6]，還包括位于膜或細胞質(zhì)中的VDR通過其與細胞中的各種靶蛋白相互作用而介導的快速非基因組作用[7]。

2 維生素D代謝酶和VDR在雌性生殖系統(tǒng)中的分布

雌性生殖系統(tǒng)是雌性動物體內(nèi)完成生殖過程的器官總稱。高等脊椎動物的雌性生殖系統(tǒng)包括卵巢、輸卵管、子宮、陰道和外生殖器，外生殖器主要腺體為陰核腺和乳腺，而且胎生的雌性高等脊椎動物在生殖過程中有胎盤產(chǎn)生。目前研究發(fā)現(xiàn)VDR和維生素D代謝酶廣泛分布于雌性生殖系統(tǒng)(如表1所示)，說明VD3參與雌性生殖過程。

表1 VDR和維生素D代謝酶在大鼠、小鼠和人雌性生殖系統(tǒng)中的分布

注：“-”代表未發(fā)現(xiàn)

研究顯示，VDR主要分布在雌性大鼠卵巢基質(zhì)中的生發(fā)上皮細胞、卵巢的顆粒細胞、黃體細胞、濾泡細胞、輸卵管和子宮的上皮細胞以及陰道上皮細胞中。VDR在大鼠發(fā)情前期和發(fā)情周期的陰道上皮中呈現(xiàn)規(guī)律性的表達與不表達，切除卵巢大鼠的陰道上皮中沒有VDR表達。如Yildirim等[10]比較了各發(fā)情周期大鼠和卵巢切除大鼠陰道上皮中VDR的分布，發(fā)現(xiàn)處于發(fā)情周期大鼠的陰道基底和上皮細胞中有VDR，在發(fā)情周期中VDR對陰道鱗狀上皮的增殖和分化有著重要的作用，與雌激素的作用相似，而發(fā)情前期大鼠陰道并未檢測到VDR，卵巢切除大鼠在陰道上皮和陰道基底未檢測到VDR，研究結果表明VDR在大鼠陰道中存在具有特殊性。VD3可使切除卵巢大鼠的陰道上皮層中產(chǎn)生角化層并使陰道上皮中VDR的表達從無到有。如Basak等[11]研究發(fā)現(xiàn)，VD3注射治療的卵巢切除大鼠陰道上皮是高度分層的角化層，其陰道免疫組織化學染色顯示有VDR存在，而卵巢切除大鼠對照組的陰道上皮層沒有角化層存在，其陰道免疫組織化學染色顯示沒有VDR存在，表明VD3能夠誘導陰道上皮增生，并上調(diào)陰道上皮中的VDR的表達。

研究顯示，VDR主要分布在雌性小鼠的卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、蛻膜、胎盤中。Zarnani等[12]發(fā)現(xiàn)VDR存在于小鼠雌性生殖系統(tǒng)中，其表達在整個發(fā)情周期有差異。與發(fā)情間期相比，發(fā)情期前期、發(fā)情期、發(fā)情后期小鼠的樹突狀細胞、巨噬細胞和子宮內(nèi)膜的腺體、卵巢的顆粒細胞、上皮細胞、卵丘細胞和輸卵管上皮細胞強烈表達VDR，并且在發(fā)情期表達量最高。Tavera-Mendoza等[13]通過VD3激活VDR誘導的乳腺癌細胞自噬，提高患者生存率，在乳腺癌轉移患者中VD3激活VDR誘導的乳腺癌細胞自噬作用逐漸喪失，表明在小鼠補充膳食VD3會增加其正常乳腺細胞中癌細胞自噬的基礎水平。Shahbazi等[14]研究懷孕小鼠不同妊娠時期的蛻膜、胎盤和卵巢中VDR表達，發(fā)現(xiàn)小鼠整個懷孕時期蛻膜、胎盤和卵巢中的VDR mRNA和蛋白表達均顯著，與妊娠中期相比妊娠晚期胎盤VDR基因表達顯著增加，妊娠早期到中期蛻膜中的VDR表達水平顯著上升，與非懷孕小鼠的子宮內(nèi)膜相比，懷孕小鼠蛻膜中VDR表達較高，研究結果顯示懷孕期間VDR在生殖器官中的表達顯著升高，表明其在雌性生殖生物學中的重要作用。

研究顯示，VDR主要分布在女性的卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、胎盤中。Kim T H等[15]通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，無論月經(jīng)周期和血清25D3水平如何變化，VDR在人陰道上皮和基底層均有分布。張純等[16]發(fā)現(xiàn)VDR在人輸卵管黏膜上皮有表達。Ranjzad等[17]研究表明VDR基因多態(tài)性通過影響其對促黃體生成素和性激素結合球蛋白水平以及胰島素抵抗來參與女性多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的發(fā)病。Sayegh等[18]發(fā)現(xiàn)VDR、CY24A1和CYP27B1分布在子宮內(nèi)膜異位癥婦女的正常循環(huán)子宮內(nèi)膜以及異位和異位子宮內(nèi)膜中。Pospechova等[19]研究VDR在胎盤、人胎盤絨毛癌細胞BeWo和人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞JEG-3的表達，發(fā)現(xiàn)VDR位于人胎盤滋養(yǎng)細胞中，并在分離的滋養(yǎng)細胞中表達，然而VDR在絨毛膜細胞系中表達低且無轉錄活性。Zhalehjoo等[20]通過比較正常乳腺組織和腫瘤組織中VDR mRNA和蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織有VDR表達，腫瘤組織中VDR mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁正常組織。

3 VD3與雌性生育力

雌性生育力指雌性動物每個排卵周期妊娠的可能性，主要體現(xiàn)在雌性動物妊娠、產(chǎn)子、子代成活率3個方面，其中人類還涉及到體外受精。VD3對大鼠、小鼠和人類的雌性生育力具有重要影響。

VDR是活性VD3結合發(fā)揮其生物學作用的關鍵受體，CYP27B1基因是編碼產(chǎn)生活性VD3的關鍵酶1α-羥化酶的基因。VDR和CYP27B1基因敲除小鼠是研究VD3與雌性生育的重要動物模型。Kinuta等[21]通過敲除小鼠VDR基因建立VDR缺失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)VDR缺失小鼠性腺功能不足，雌性小鼠表現(xiàn)為子宮發(fā)育不良、卵泡發(fā)育受損、促黃體生成素和卵泡刺激素的血清含量升高，說明VDR是雌性小鼠維持正常生殖功能的重要因子；VDR缺乏小鼠卵巢芳香化酶基因表達量較低，芳香化酶活性降低，血清中雌二醇含量較低，說明VDR參與小鼠雌激素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)并發(fā)揮著重要的作用。Yoshizawa等[22]發(fā)現(xiàn)，斷奶前VDR基因敲除小鼠的生長發(fā)育正常，斷奶后VDR基因敲除的小鼠不能正常生長發(fā)育，出現(xiàn)如發(fā)育不全、脫毛、低鈣血癥和不育癥，證明VDR在雌性動物生殖中起重要的作用。Panda等[23]研究通過敲除VD3的關鍵酶1α-羥化酶的編碼基因CYP27B1構建維生素D缺乏的動物模型，研究顯示CYP27B1基因敲除小鼠斷奶后出現(xiàn)低鈣血癥和不孕，子宮發(fā)育不全且缺乏黃體。

研究證實VD3對雌性大鼠生育力有重要影響。Halloran等[24]研究VD3缺乏對生育能力、生殖能力、胎兒和新生兒發(fā)育的影響，給剛斷乳大鼠喂食缺乏VD3的食物一直喂至交配，發(fā)現(xiàn)VD3缺乏的雌性大鼠可以生育，然而與正常飼喂的大鼠相比，VD3缺乏雌性大鼠整體生育率降低了75%，產(chǎn)仔數(shù)減少了30%，哺乳期第6天到第15天的新生兒生長發(fā)育遲緩。Kwiecinksi等[25]發(fā)現(xiàn)，VD3缺乏導致雌性大鼠生育力大幅下降，而這與血清中的鈣、磷含量無關。此外VD3缺乏對子代雌性小鼠的生殖也產(chǎn)生一定的影響，Nicholas等[26]通過對3組母鼠孕期、哺乳期喂食缺乏VD3的食物，研究了孕期VD3缺乏對子代生殖的影響，發(fā)現(xiàn)孕期VD3缺乏的小鼠其子代雌性小鼠的陰道開口時間推后，發(fā)情周期不規(guī)則，排卵過少。上述研究表明VD3對小鼠生育力具有非常重要的作用，然而也有一些研究認為VD3與生殖并沒有直接關系。如Halloran等[27]通過給母鼠喂食維生素D缺乏的食物，其生產(chǎn)的仔鼠斷奶后血漿中鈣、磷濃度正常，發(fā)育正常，認為VD3及其代謝物與大鼠胎兒發(fā)育沒有直接關系；Johnson等[28]通過給VDR基因敲除的小鼠飼喂高鈣食物，發(fā)現(xiàn)雌性小鼠恢復正常的生殖能力，認為雌性小鼠的生殖與VD3無直接關系。造成這一分歧的主要原因是沒有考慮血液中鈣、磷和VD3代謝物的作用，另外血清和濾泡液中VD3水平對懷孕和子代活產(chǎn)率的影響仍不清楚。

VD3對女性生育力有重要影響，女性妊娠期25D3充足對其生殖有益，而25D3不足對其生殖會產(chǎn)生不利的影響。Kiely等[29]在愛爾蘭一個大型的前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，女性妊娠期血清中25D3濃度大于75 nmol/L時可降低子宮胎盤功能障礙的風險。Lepsch等[30]研究女性妊娠早期VD狀態(tài)與妊娠期血脂變化的關系，證明了妊娠早期25D3不足導致懷孕期間血脂濃度升高，表明在懷孕初期補充并確保孕婦體內(nèi)有足夠的VD3以預防妊娠高血脂綜合征非常重要。Tabatabaei等[31]發(fā)現(xiàn)加拿大孕婦VD3水平與早產(chǎn)風險之間呈現(xiàn)反比關系，VD3缺乏會導致胎兒早產(chǎn)風險增加，表明孕婦早期維生素D缺乏與加拿大婦女早產(chǎn)風險增加有關。然而，也有觀點認為25D3狀態(tài)與生殖無關。如Neville等[32]采用橫向前瞻性研究顯示，妊娠期和非妊娠期25D3無顯著性差異(P=0.222)證明VD3與雌性生育無關。此外，孕婦補充VD3對其下一代有益，如Wolsk等[33]發(fā)現(xiàn)孕婦產(chǎn)前補充VD3可降低兒童患哮喘的風險。然而研究表明，25D3不足對下一代生長發(fā)育沒有影響。Eggemoen等[34]研究多種族女性懷孕期間的維生素D水平與新生兒出生體重和身體組成的關系，發(fā)現(xiàn)在VD3缺乏的患病率高的孕婦中，母體VD3水平與任何一種新生兒出生體重和身體組成之間沒有獨立的關系。

VD3對女性生育力的影響還體現(xiàn)在體外受精方面，體內(nèi)VD3水平直接影響到體外受精(in vitro fertilization，IVF)的成功率。Ozkan等[35]研究了25D3水平和IVF周期參數(shù)與結果的關系，發(fā)現(xiàn)血清和卵泡液25D3濃度較高的不育婦女體外受精更容易成功，受精卵容易著床并最終懷孕。Rudick等[36]發(fā)現(xiàn)VD3缺乏的捐卵者的卵母細胞經(jīng)體外受精后，移入VD3健康的代孕者即受精卵接受者后其妊娠率正常，而VD3健康的捐卵者的卵母細胞經(jīng)過體外受精后，移入VD3缺乏的代孕者即受精卵接受者后其妊娠率較低，表明VD3健康與否直接影響到體外受精的妊娠率，推測也許VD3通過子宮內(nèi)膜發(fā)揮作用。Paffoni等[37]調(diào)查血清25D3水平低于20 ng/mL的女性，發(fā)現(xiàn)血清25D3水平最高的女性IVF后懷孕幾率最高。Farzadi等[38]研究卵泡液中25D3水平和輔助生殖結果的關系，發(fā)現(xiàn)輔助生殖技術下可懷孕組卵泡液中25D3水平比非懷孕組顯著升高。然而有一些觀點認為VD3不影響IVF成功率。Lv等[39]發(fā)現(xiàn)，不孕婦女血清VD3水平的高低與其體外受精后的臨床妊娠率差異沒有顯著相關性。Neville等人[32]采用橫向前瞻性研究IVF/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的男性和女性的維生素D狀況，顯示妊娠結果與男女雙方的VD3狀態(tài)沒有相關性。造成這一分歧的主要原因是研究方法的問題，如研究的樣本量較小，研究的樣本具有特異性，如女性高度不育，研究設計存在差異，如前瞻性與回顧性設計等。

4 VD與雌激素

雌性生殖系統(tǒng)中存在著大量且復雜的信號通路，目前尚且沒有較為明確的特征或者機制能夠評價雌性生殖系統(tǒng)生長、發(fā)育、孕育的過程。雌激素分為兩大類，即雌性激素和孕激素。其中雌性激素包括雌酮、雌二醇等，主要為雌二醇，由卵巢顆粒細胞產(chǎn)生。孕激素包括黃體酮、異炔諾酮、甲炔諾酮、已酸孕酮等，主要為孕酮即黃體酮，由卵巢的黃體細胞產(chǎn)生。另外女嬰胚胎期產(chǎn)生一定數(shù)量的原始卵泡，出生后原始卵泡數(shù)量不再增加，女性卵巢皮質(zhì)內(nèi)含有的原始卵泡被稱為卵巢儲備。近年研究表明卵巢的顆粒細胞產(chǎn)生的抗苗勒管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)作為新的卵巢儲備標志物對雌性生殖也有非常重要的影響[40]。

雌二醇是一種甾體雌激素，主要由卵巢成熟濾泡分泌，能增進和調(diào)節(jié)雌性生殖器官及副性征的正常發(fā)育。細胞色素P450是卵巢雌激素包括雌二醇生成過程中的重要酶，由CYP19編碼。Kinuta等[21]研究發(fā)現(xiàn)，VDR敲除的雌性小鼠中CYP19的表達受抑制，細胞色素P450活性降低，導致雌激素缺乏，這表明VD3可調(diào)控雌激素的生成。Potashnik等[41]研究卵巢刺激體外受精-胚胎移植過程中內(nèi)源性雌二醇與血清及卵泡液中的VD3水平之間的關系時發(fā)現(xiàn)，雌二醇增加時，血清中VD3水平也增加，而VD3的其他代謝產(chǎn)物如25D3、1α24，25(OH)2D3、24，25(OH)2D3并沒有變化；首次發(fā)現(xiàn)卵泡液中也存在VD3代謝產(chǎn)物，當雌二醇增加時卵泡液中VD3代謝產(chǎn)物也有所變化，因此在促性腺激素誘導的卵巢刺激時提高循環(huán)雌二醇含量可顯著增加血清中1,25D3水平。然而也有不同的觀點，Merhi等[42]研究維生素D改變參與人卵巢顆粒細胞濾泡發(fā)育和類固醇生成的基因，通過收集女性濾泡中的顆粒細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中VD3增加時雌二醇的產(chǎn)生沒有變化，造成這種觀點差異的原因可能是由于濾泡中VD3代謝物的影響。另外朱建林[43]通過添加不同梯度濃度VD3體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)VD3對雌二醇的分泌產(chǎn)生抑制作用，且隨VD3濃度增加抑制作用更加明顯，這表明VD3對雌性生殖的性腺毒性作用。

孕激素(progesterone)由卵巢的黃體細胞生成，主要為孕酮，是一種促進和維持妊娠的類固醇激素。Thangamani等[44]研究表明孕酮直接上調(diào)T細胞中VDR基因的表達，增加T細胞對1,25D3的敏感性，從而調(diào)節(jié)1,25D3在T細胞中的作用，這對于防止妊娠期間的不良免疫反應有重要影響。Kim C H等[45]發(fā)現(xiàn)孕酮直接上調(diào)T細胞中VDR基因的表達，這一發(fā)現(xiàn)提示可將孕酮與1,25D3的功能相結合，兩種激素協(xié)同作用可對免疫系統(tǒng)進行連續(xù)和有效的調(diào)節(jié)。Hong等[46]從豬卵巢中分離出顆粒細胞，進行實時定量PCR和蛋白免疫印跡分析，結果顯示VD3顯著改變顆粒細胞中孕酮生物合成相關基因的轉錄和翻譯，ELISA檢測豬顆粒細胞培養(yǎng)基中的孕酮濃度隨VD3的反應降低，表明VD3通過調(diào)節(jié)類固醇生成酶從而影響豬卵巢顆粒細胞的孕酮分泌。Merhi等[42]培養(yǎng)女性濾泡中的顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)VD3增加孕酮生成酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)的mRNA水平，表明VD3可通過提高3β-HSD的活性而增加孕酮的釋放。

抗苗勒管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)屬于轉化生長因子β家族成員，是一種二聚糖蛋白，由圍繞雌性動物卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生，主要功能是調(diào)控胚胎的性別分化。Xu等[47]分離恒河猴卵巢的卵泡細胞進行離體培養(yǎng)，將卵泡隨機分配到對照組、低劑量VD3(LVD3，25 pg/mL)和高劑量VD3(HVD3，100 pg/mL)，結果顯示第5周時LVD3組的AMH濃度比HVD3高36%，低劑量VD3上調(diào)AMH mRNA表達，表明1,25D3補充促進卵母細胞離體培養(yǎng)時的卵泡發(fā)育。Dennis等[48]研究發(fā)現(xiàn)血清25D3與AMH呈季節(jié)性變化，冬季AMH水平與夏季相比減少18%(P≤0.01)，血清AMH與25D3呈正相關表明VD3補充防止季節(jié)性AMH變化。Merhi等[42]體外培養(yǎng)女性卵巢顆粒細胞發(fā)現(xiàn)，VD3含量升高時AMH受體mRNA表達降低，說明VD3下調(diào)AMH的作用。然而Chang等[49]的一個樣本量為70的橫向研究顯示，血清VD3水平與AMH水平無關。造成這種差異的原因可能是沒有考慮濾泡液中VD3代謝物對結果的影響及橫向研究設計的局限性。后續(xù)研究應排除季節(jié)引起的變化，同時兼顧卵泡液和血清中VD3代謝物對AMH的影響。

5 結語和展望

VDR在雌性生殖系統(tǒng)的存在以及VD3對雌性生育力，雌激素的影響等證據(jù)表明VD3在雌性生殖中的作用非常重要，但部分研究認為VD3對雌性生殖沒有直接的影響，這種分歧在VD3與雌性激素以及AMH的研究中被進一步放大。造成這種分歧的主要原因可能有，一是在嚙齒類動物的研究中，未能排除一些影響因素，如沒有考慮VD3的性腺毒性，VD3對血液中鈣、磷和VD3代謝物的作用等；二是可能研究設計存在差異，樣本量較小，選擇的樣本具有特異性，這部分主要體現(xiàn)在對女性生殖方面，如選擇研究的女性高度不育；三是沒有考慮VD3或是其代謝物不僅直接參與雌性生殖，在雌性生殖系統(tǒng)大量復雜信號通路的上游是否有作用，值得我們進一步研究?？傊?，VD3與雌性生殖是近年研究的熱點，然而VD3在雌性生殖系統(tǒng)大量復雜的信號通路中究竟扮演怎樣的角色還需要進一步深入的研究。

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