蘿卜籽粕中黃酮的提取及純化工藝研究

朱海霞 - 張小芳 - 高 洋 丁婭娜 -

(漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462000)

蘿卜籽又稱萊菔子，是十字花科植物蘿卜成熟種子的稱法[1]。蘿卜籽粕是生產(chǎn)蘿卜籽油后所余的副產(chǎn)物。近些年的研究表明，蘿卜籽中含有大量的硫苷、黃酮、甾醇等活性物質(zhì)[2]，這些物質(zhì)的存在與蘿卜籽具有很好的抗菌活性、解毒、降壓、預(yù)防心血管疾病的作用有很大關(guān)系[3-5]。目前關(guān)于蘿卜籽的研究多集中在油脂、多糖、蛋白等[6-8]，關(guān)于其黃酮的研究尚無相關(guān)報(bào)道。

關(guān)于黃酮的提取方法有很多[9-11]，熱水提取法工藝成本低、對(duì)環(huán)境及人類無毒害，可應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[12-13]，而超聲波輔助在分離提取黃酮類成分中已得到廣泛應(yīng)用[14-15]。本試驗(yàn)擬采用超聲波輔助熱水提取法對(duì)蘿卜籽粕中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)所提取的產(chǎn)物進(jìn)行脫蛋白、脫多糖純化，以期為蘿卜籽中黃酮的提取及蘿卜籽粕的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蘿卜籽粕：武漢市蔬菜科學(xué)研究所生產(chǎn)蘿卜籽油后所剩余的蘿卜籽餅粕，經(jīng)粉碎后備用；

98%蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：博美生物科技有限責(zé)任公司；

氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

鹽酸、九水硝酸鋁、亞硝酸鈉：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

無水三氯化鐵：分析純，上海展云化工有限公司；

氯仿：分析純，魯西化工集團(tuán)股份有限公司；

蒽酮：分析純，鄭州冠輝化工產(chǎn)品有限公司；

濃硫酸：分析純，山東淄博華贊化工有限公司；

無水葡萄糖：分析純，河南云創(chuàng)化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：TGL-20bR型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外分光光度計(jì)：752N型，上海精科儀電器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE5203型，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；

真空干燥箱：DF-6020型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

多功能超聲波提取儀：Biosafer-4000Q型，賽飛(中國(guó))有限公司；

電子天平：FA1604型，上海天平儀器廠；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：HH600型，力辰科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮的測(cè)定

(1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照文獻(xiàn)[9]，蘆丁曲線濃度梯度分別為：0.06，0.12，0.18，0.24，0.30，0.36，0.42，0.48，0.54，0.60 mg/mL。

(2) 提取液中黃酮含量的測(cè)定：按照亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法提取完成后，取200 μL的提取液在510 nm下測(cè)定吸光度值，得回歸方程y=3.875 3x+0.273 9，R2=0.999 6。

1.3.2 多糖的測(cè)定 按照硫酸-蒽酮法進(jìn)行測(cè)定，以多糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程y=10.079x+0.009 5，R2=0.999 0。

1.3.3 蛋白質(zhì)的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[16]。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=10.086x+0.007，R2=0.999 2。

1.3.4 超聲波輔助提取蘿卜籽粕中黃酮

(1) 超聲功率：固定超聲時(shí)間10 min、料液比1∶20 (g/mL)，考察超聲功率(100，200，300，500，700 W)對(duì)蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(2) 超聲時(shí)間：固定超聲功率500 W、料液比1∶20 (g/mL)，考察超聲時(shí)間(5，10，15，20，25 min)對(duì)蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(3) 料液比：固定超聲功率500 W、超聲時(shí)間10 min，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對(duì)蘿卜籽粕中黃酮提取效果的影響。

(4) 正交試驗(yàn)：以超聲功率、超聲時(shí)間、料液比為因素，通過正交試驗(yàn)篩選出最佳的提取工藝。

1.3.5 蘿卜籽粕中黃酮脫多糖試驗(yàn)

(1) 乙醇溶液濃度：固定脫除時(shí)間4 h、黃酮和乙醇溶液的體積比1∶3，考察乙醇溶液濃度(50%，60%，70%，80%，90%)對(duì)蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(2) 脫除時(shí)間：固定乙醇溶液濃度80%、黃酮和乙醇溶液的體積比1∶3，考察脫除時(shí)間(0.5，1，2，3，4，5 h)對(duì)蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(3) 黃酮和乙醇溶液的體積比：固定乙醇溶液濃度80%、脫除時(shí)間4 h，考察黃酮和乙醇溶液的體積比(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5)對(duì)蘿卜籽黃酮中多糖脫除效果的影響。

(4)正交試驗(yàn)：以乙醇濃度、黃酮-乙醇體積比、脫糖時(shí)間為因素，通過正交試驗(yàn)篩選出最佳的多糖去除工藝。所得的試驗(yàn)結(jié)果按照式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

式中：

t——總得分；

p——多糖脫除率，%；

h——黃酮損失率，%。

1.3.6 蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白試驗(yàn)

(1) 脫除時(shí)間：固定氯仿-正丁醇體積比2∶1、Sevage溶液與黃酮體積比4∶1，考察脫除時(shí)間(10，20，30，40 min)對(duì)蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響；

(2) 氯仿-正丁醇體積比：固定脫除時(shí)間30 min、Sevage溶液與黃酮體積比4∶1，考察氯仿-正丁醇體積比(2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對(duì)蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響；

(3) Sevage溶液與黃酮體積比：固定脫除時(shí)間30 min、氯仿-正丁醇體積比2∶1，考察Sevage溶液與黃酮體積比(2∶1，3∶1，4∶1，5∶1)對(duì)蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白效果的影響。

(4)正交試驗(yàn)：以脫除時(shí)間、氯仿-正丁醇體積比、Sevage溶液與黃酮體積比為因素，通過正交試驗(yàn)篩選出脫除蛋白效果最佳的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜籽粕中總黃酮含量

用精密電子天平稱取蘿卜籽粕1 g，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)得黃酮含量分別為：2.02%，2.11%，2.04%，黃酮總含量的平均值為2.06%。

2.2 超聲波浸提對(duì)蘿卜籽粕中黃酮提取的影響

2.2.1 超聲波功率 由圖1可知，隨超聲波功率的增加，蘿卜籽粕中黃酮浸出率先增加后減少，在超聲波功率500 W時(shí)浸出率較高。可能是由于超聲波功率越高，固液傳波速度越好，物料升溫也越好，且對(duì)物料細(xì)胞破壞效果越好，有助于黃酮提出，當(dāng)超聲波功率增加到一定程度時(shí)，高超聲波功率可能分解了蘿卜籽粕中黃酮，使浸出率減少。綜合分析，選擇超聲波功率為500 W。

圖1 超聲波功率對(duì)黃酮浸出率的影響Figure 1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of flavonoids

2.2.2 超聲波浸提時(shí)間 由圖2可知，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜籽粕中黃酮浸出比例逐漸升高，10 min后，浸出率降低?？赡苁浅暡ㄌ幚磉^久，溫度過高，黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，所以黃酮的浸出率降低。綜合分析，選擇超聲波浸提時(shí)間為10 min。

2.2.3 浸提料液比 由圖3可知,隨溶劑的增加，蘿卜籽粕中黃酮浸出率先升后降，當(dāng)料液比為1∶20 (g/mL)時(shí)，黃酮浸出率最高。因此，選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

圖2 超聲波時(shí)間對(duì)黃酮浸出率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on extraction rate of flavonoids

圖3 料液比對(duì)黃酮浸出率的影響Figure 3 Effect of feed liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 正交試驗(yàn) 以超聲功率、超聲時(shí)間、料液比為因素，采用三因素三水平L9(33)的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果見表1、2。

由表2可知，各因素對(duì)蘿卜籽黃酮的浸出率影響順序?yàn)槌暪β?超聲時(shí)間>料液比，最佳參數(shù)組合為A2B2C1，即超聲波功率500 W，超聲波時(shí)間10 min，料液比1∶15 (g/mL)，該條件下測(cè)得蘿卜籽黃酮的浸出率為1.90%，優(yōu)于正交組合中的試驗(yàn)結(jié)果，說明此結(jié)果可作為優(yōu)化后的提取條件。

通過上述試驗(yàn)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在溫度，料液比相似的狀況下，超聲波輔助提純速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于常規(guī)熱水提純，因此選用超聲波輔助提純能夠極好地提高提純效果。

2.3 蘿卜籽粕中黃酮溶液脫多糖結(jié)果分析

通過單因素試驗(yàn)，得出用醇沉法除多糖最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度為85%，黃酮提取液-乙醇體積比為1∶3.5，提取時(shí)間為4 h，根據(jù)此三因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平及結(jié)果見表3、4。

表1 超聲波提取蘿卜籽粕中黃酮試驗(yàn)因素水平表Table 1 Ultrasonic extraction of flavonoids of semen Raphani orthogonal table

表2 超聲波提取蘿卜籽粕中黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Ultrasonic extraction of flavonoids of semen Raphani orthogonal table

由表4可知，脫除時(shí)間對(duì)黃酮提取液脫多糖影響最大，其次是乙醇濃度，黃酮提取液-乙醇體積影響較小。蘿卜籽黃酮提取液最佳的脫多糖條件是A3B3C2，即乙醇濃度85%，黃酮提取液-乙醇體積比1∶3.5，提取時(shí)間4 h，能脫去73.2% 的多糖，此時(shí)的黃酮損失率在34.86%。在正交試驗(yàn)表中脫除率較高，而黃酮的損失率較低，說明此條件是脫除蘿卜籽粕中黃酮中多糖的適宜條件。

表3 蘿卜籽粕中黃酮多糖脫除試驗(yàn)因素水平表Table 3 Flavonoids polysaccharides in semen Raphani removal orthogonal table

表4蘿卜籽粕中黃酮中多糖脫除正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 5 The removal of polysaccharides in semen Raphani flavone orthogonal experimental results

試驗(yàn)數(shù)ABC多糖脫除率/%黃酮損失率/%總得分111163.5338.5293.25212269.5233.50101.26313365.0434.0698.46421268.3033.27100.88522369.3236.3298.34623166.0731.90101.14731365.1033.0099.55832164.3232.05100.11933273.2034.86101.74K197.6697.8998.16K2100.1299.90101.29K3100.47100.4598.78R2.812.553.13

2.4 蘿卜籽粕中黃酮脫蛋白結(jié)果分析

通過單因素試驗(yàn)，得出Sevage法脫除蛋白各因素最佳參數(shù)為：沉淀時(shí)間20 min，氯仿-正丁醇體積比為3∶1；Sevage溶液-黃酮體積比3∶1，根據(jù)此三因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。正交表試驗(yàn)因素水平及結(jié)果見表5、6。

表5 蘿卜籽粕中黃酮蛋白質(zhì)脫除試驗(yàn)因素水平表Table 5 The orthogonal table of protein removal in flavonoids of semen Raphani

表6蘿卜籽粕中黃酮蛋白質(zhì)脫除正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 6 The experimental results of orthogonal protein removal in flavonoids of semen Raphani

試驗(yàn)數(shù)ABC蛋白質(zhì)脫除率/%黃酮損失率/%總得分111165.1223.11109.45212268.0524.14109.89313367.0823.86109.68421270.2124.73110.38522371.3224.12111.54623170.0620.06114.97731375.3225.04112.62832169.5328.08106.69933273.2024.67111.93K1109.67110.82110.37K2112.30109.37110.73K3110.41112.19111.28R2.622.820.91

由表6可知，氯仿和正丁醇的體積比對(duì)結(jié)果影響最大；其次是脫蛋白時(shí)間，影響最小的是Sevage-黃酮體積比。蘿卜籽粕中黃酮提取液最佳的脫蛋白條件是A2B3C1，即沉淀時(shí)間20 min，氯仿-正丁醇體積比3∶1；Sevage-黃酮體積比2.5∶1，此時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為70.06%，黃酮損失率為20.06%。在正交試驗(yàn)表中損失率最低，說明此條件為Sevage法脫除蛋白的最佳條件。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過超聲波輔助熱水法提取蘿卜籽粕中黃酮，并研究醇沉法、Sevage法分離純化效果。結(jié)果表明，在超聲波功率500 W、超聲波時(shí)間10 min、料液比1∶15 (g/mL)的條件下提取黃酮，于乙醇濃度85%、黃酮提取液-乙醇體積比1∶3.5、提取時(shí)間4 h的條件下脫除多糖，再于沉淀時(shí)間20 min、氯仿-正丁醇體積比3∶1、Sevage-黃酮體積比2.5∶1的條件下脫蛋白時(shí)，蘿卜籽粕黃酮的分離純化效果最佳。后續(xù)可對(duì)不同的提取方式及純化方式進(jìn)行比較研究，而且有必要深挖黃酮類化合物的藥學(xué)作用及其結(jié)構(gòu)。

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