南江黃羊ARHGAP11A基因SNPs篩選及其與生長性狀的關聯(lián)分析

王嘉欣，張德鵬，譚永乾，馮 靜，宋天增，陳 愉，張紅平，李 利*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院，拉薩 850000；4.四川南江黃羊原種場，四川南江 635600）

ARHGAP11A（Rho GTPase-activating protein 11A）基因，也被稱為 KIAA0013 或 MGC70740，屬于RhoGTPs（Rho GTPase-activating proteins）酶激活蛋白的一員，與細胞內(nèi)信號分子Rho GTPases的調控息息相關[1]。RhoGAPs結合Rho GTPases在包括能動性、收縮性、生長、分化等細胞進程中至關重要[2-3]。

ARHGAP11A通過Rho GTPase和GPCR（G protein coupled receptor）信號通路參與激活GTPase活動，從而間接控制細胞的生物學功能，包括細胞的形態(tài)、擴散、遷移、內(nèi)吞以及細胞周期進程[4]。在哺乳動物癌細胞中發(fā)現(xiàn)，ARHGAP11A誘導Rac1的活性從而抑制RhoA的相對增強是癌細胞遷移和侵襲的關鍵[5]。在有絲分裂中ARHGAP11A基因沉默則會導致有絲分裂細胞膜起泡，RhoA的激活速率增強[6]。因此，ARHGAP11A表達水平影響細胞的增殖和凋亡[1]，但目前關于ARHGAP11A基因在家畜上的研究未見報道。

南江黃羊是我國培育的第一個肉用山羊品種，具有體格高大，生長發(fā)育快，四季發(fā)情，繁殖率高，抗病力強，采食性好，適宜粗放飼養(yǎng)等特點[7]。同時，南江黃羊骨骼肌衛(wèi)星細胞（SMSCs）具有突出的增殖和融合率能力[8]。因此，本試驗采用PCR產(chǎn)物直接測序法，檢測南江黃羊ARHGAP11A基因外顯子及非編碼區(qū)域的單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，并將這些位點與其生長性狀進行關聯(lián)分析，以期篩選出對南江黃羊生長性狀有顯著影響的多態(tài)位點，為南江黃羊的分子育種提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物和血樣采集

試驗中南江黃羊母羊群體（n=243）均來自南江黃羊原種場。所有羊只在同一環(huán)境條件下進行相同的飼養(yǎng)管理。羊群飼養(yǎng)方式為放牧加適當補飼，飼料營養(yǎng)水平滿足羊生長需求。

每一只試驗羊頸靜脈采集全血1.5mL，加入肝素鈉抗凝，-20℃冰箱中保存以備基因組DNA提取。

1.2 南江黃羊生產(chǎn)性能測定

按照常規(guī)方法分別測定南江黃羊的初生重（birth weight，BWT）以及 2月齡、6月齡、12月齡及24月齡共 4個生長階段的體重（weight，WT）、體長（body length，BL）、體高（body height，BH）和胸圍（chest circumference，CC）。

1.3 引物設計

為了擴增山羊ARHGAP11A基因的12個外顯子以及部分非編碼區(qū)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的山羊基因組序列以及預測的ARHGAP11A mRNA（XM_005685462.3），采用Primer Premier 5.0軟件設計了14對引物（見表1）并用Oligo 6.0和Blast驗證其特異性。引物由成都擎科生物公司合成。

1.4 基因組DNA的提取及DNA的質量檢測

采用常規(guī)血液基因組提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取山羊基因組DNA后，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠圖像分析儀BIO-RAD ChemDOC XRS中紫外成像，用Quality One 4.6.2軟件分析圖像以判定DNA完整性。DNA的純度與濃度利用核酸蛋白檢測儀（BIO-RAD，USA）測定。對符合要求的樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目標片段的PCR擴增和測序

以獲得的山羊基因組DNA為模板，根據(jù)PCR擴增總體系（2×Master Mix Taq 酶 15.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，滅菌dd H2O 12.0 μL）和PCR程序（95℃預變性 5 min，然后38個循環(huán)（95℃變性30s，各引物特異性Tm 30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min）進行擴增后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，選取目的條帶亮且無雜帶的PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因科技服務有限公司進行雙向測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將測序結果進行核對、組裝以確定ARHGAP11A基因的 CDS區(qū)和 UTR；利用 RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）分析序列上的調控元件。用Sequencher 4.7軟件比對各SNPs，在線進行群體中SNPs位點的基因型頻率和基因頻率以及Hardy-Weinberg 檢驗（http：//www.oege.org/software/hardyweinberg.html）。通過PHASE 2.1.1進行單倍型構建，Haploview 4.2進行連鎖不平衡分析。

表1 PCR擴增山羊ARHGAP11A基因序列的引物信息Table 1 Primers'information in amplifying goat ARHGAP11A

南江黃羊體重體尺性狀與SNPs關聯(lián)分析利用SAS（19.0）軟件中的一般線性模型進行。分析模型為：Yijkl=μ+Gk+eijkl，其中 Yijkl為個體性狀的觀測值，μ為群體均值，Gk為基因型效應，eijkl為隨機誤差。結果以平均值±標準差表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 山羊ARHGAP11A基因序列及其與其他物種的比較分析

基于NCBI中預測的山羊ARHGAP11A mRNA序列（XM_005685462.3），利用14個測序片段組裝獲得山羊ARHGAP11A基因序列4235bp，其中CDS序列全長3 069 bp，其余為5′UTR和3′UTR的部分序列（分別 486 bp和680 bp）。將山羊ARHGAP11A基因核苷酸序列與小鼠（NM_181416.3）、綿羊（XM_004010425.3）、牛（XM_870134.6）、人（NM_014783.5）和豚鼠（XM_003475662.2）的進行分析，發(fā)現(xiàn)物種之間相似性達到78%以上。其中，山羊與綿羊的相似性最高（99%），其次是與牛（97%）（見圖1）。利用預測出的ARHGAP11A氨基酸序列進行對比也發(fā)現(xiàn)物種間ARHGAP11A蛋白高度相似，尤其是綿羊、山羊和牛這3種反芻動物。這些說明ARHGAP11A基因在物種之間高度保守，暗示其在個體發(fā)育中的可能具有重要作用（見圖2）。

圖1 物種間ARHGAP11A基因外顯子序列相似性分析Figure 1 Sequence similarity of ARHGAP11A exons among species

2.2 南江黃羊群體中ARHGAP11A基因的SNP位點

在南江黃羊群體中共發(fā)現(xiàn)ARHGAP11A基因16個SNPs位點（見圖3a）。其中1個突變（g.-340A＞G，以翻譯起始為+1）位于 5′UTR，在 Exon 1中也只有 1個（g.39G＞C），其余 14個分別位于 Exon 12（7個 SNPs）和 3′UTR（7 個 SNPs）（見圖 3b）。ARHGAP 11A基因編碼區(qū)的8個 SNPs中有 3個SNPs（g.39G＞C，g.2565C＞T，g.3060T＞A）是同義突變，其余 5個 SNPs（g.2852T＞C，g.2856G＞A，g.2907G＞A，g.2912 G＞A，g.2950G＞A）為錯義突變。對應的氨基酸改變?nèi)缦拢豪i氨酸→丙氨酸（g.2852T＞C）、甲硫氨酸→異亮氨酸（3371C＞T）、甲硫氨酸→異亮氨酸（g.2907G＞A）、精氨酸→賴氨酸（g.2912G＞A）、纈氨酸→異亮氨酸（g.2950G＞A）。

圖2 6個物種間預測的ARHGAP11A氨基酸序列對比Figure 2 Comparison of predicted amino acid sequence of ARHGAP11A among 6 species

利用在線軟件 RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）分析發(fā)現(xiàn)，ARHGAP11A具有包括myogenin（cagctg）以及 MEF2A（tatttttaaa）、MEF2C（tattttt）和MEF2D（aaaatag）在內(nèi)的多個轉錄因子調控基序（Transcriptional regulatory motif，TRM）。有趣的是，在南江黃羊群體中發(fā)現(xiàn)的16個SNPs中7個位于轉錄調控元件內(nèi)（見表2），其中既涉及內(nèi)含子剪切增強子（intron splicing enhancer，ISE），如 g.-340A＞G和g.3155T＞C；也有外顯子剪切增強子（exon splicing enhancer，ESE），如 g.3680 T＞C，而且 g.3680 T＞C 位點還涉及多聚腺苷化（Polyadenylation sites，PAS）。另外還有 4個位點（g.39G＞C、g.3060T＞A、g.3483A＞G和g.3525A＞G）均位于調控基序（見表2）。值得注意的是，南江黃羊群體中發(fā)現(xiàn)的7個與轉錄調控有關的SNPs中就有 3個（g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3680T＞C）集中在3′UTR端約200 bp的片段上。因此，后續(xù)重點分析這范圍內(nèi)的4個SNPs以及它們與南江黃羊生長發(fā)育的關系。

圖3 南江黃羊羊ARHGAP11A基因突變位點測序峰圖以及SNPs在ARHGAP11A基因中位置Figure 3 Mutation sites of ARHGAP11A gene in Nanjiang Yellow goats and their schematic locations

南江黃羊群體ARHGAP11A基因中g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3621G＞A 和 g.3680T＞C 這 4 個位點優(yōu)勢等位基因的頻率范圍為0.525（g.3525A＞G）到0.996（g.3680T＞C），各位點的觀測雜合度和期望雜合度分別介于0.005-0.451和0.499-0.003之間（見表3）。除了g.3525A＞G以外，其余3個位點（g.3483A＞G，g.3621G＞A 和 g.3680T＞C） 處于 Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.01），暗示群體中這 3個位點可能受到選擇的影響。利用這4個位點構建獲得4種單倍型，其中AAGT與AGGT占絕對優(yōu)勢，頻率分別為0.514和0.467（見圖4a），并且這4個SNPs位點存在一定程度的連鎖不平衡，尤其是g.3483A＞G 與g.3680T＞C之間（見圖4b）。

表2 南江黃羊群體中ARHGAP11A基因16個SNP的基因型及相關調控元件Table 2 Genotypes of 16 mutations and related regulatory motifs in ARHGAP11A gene of Nanjiang Yellow goats

表3 南江黃羊群體中ARHGAP11A基因4個SNP的基因分型檢測結果Table 3 Genotypes of 4 SNPs in ARHGAP11A gene of Nanjiang Yellow goats

2.3 南江黃羊群體ARHGAP11A基因與生長發(fā)育性狀的關聯(lián)分析

由于群體中只有1個個體在g.3680 T＞C位點突變（CC型，其余為野生型TT），因此本研究進一步分析了3個SNPs（g.3483A＞G、g.3525A＞G和g.3621G＞A）與南江黃羊不同生長階段體重、體高、體長、胸圍等指標之間關系（見表4）。結果發(fā)現(xiàn)，g.3483A＞G和g.3621 G＞A上純合突變個體（分別為GG型和AA型）具有2周歲前體重高于野生型（分別為AA型和GG型）個體的趨勢（P＞0.05）。在g.3525 A＞G位點，AG型個體不同階段的體重、體尺指標均高于GG型和AA型個體，且BWT、WT-12和CC-12與突變型GG個體差異顯著（P＜0.05），但與AA個體之間差異不顯著（P＞0.05）。進一步分析發(fā)現(xiàn) g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3621G＞A 和 g.3680T＞C 位點構建的 3種單倍型中（頻率小于1%的單倍型GGAC未分析），具有AAGT單倍型個體的體重體尺指標值最高，GGAT型個體的最低，尤其是6月齡和12月齡平均體重兩者相差多達2.5 kg以上，但兩者差異不顯著（P＞0.05）（見表4）。總的來看，無論從單SNP位點還是聯(lián)合的單倍型，所分析的ARHGAP11A基因突變均不同程度影響南江黃羊的體重體尺指標。

圖4 南江黃羊群體中ARHGAP11A 基因4個SNP 的單倍型構建和連鎖不平衡分析Figure 4 Haplotype construct and linkage disequilibrium analysis of 4 SNPs in ARHGAP11A gene in Nanjiang Yellow goats

3 討論

表4 南江黃羊ARHGAP11A基因多態(tài)性位點對其生長性狀的影響Table 4 Effect of ARHGAP11A polymorphisms on growth traits in Nangjiang Yellow goats

本實驗測序組裝得到ARHGAP11A基因包含外顯子和部分UTR的片段（4 235 bp），其中CDS區(qū)3 069 bp。對CDS以及預測的氨基酸序列比對均發(fā)現(xiàn)小鼠、綿羊、山羊、牛、人和豚鼠間ARHGAP11A基因高度保守。另外，ARHGAP11A基因還可能受到轉錄因子 myogenin以及MEF2家族中MEF2A、MEF2C和MEF2D的調控。作為肌肉特異性的轉錄因子，myogenin主要參與骨骼肌的發(fā)育和修復[9]，而肌肉組織約占哺乳動物機體重量的40%～50%。MEF2家族基因則廣泛參與動物組織器官的生長發(fā)育[10]。同時，ARHGAP11A通過Rho GTPases和GPCR信號通路參與調控眾多信號轉導途徑，從而間接控制細胞的生物學功能如細胞周期進程[4]。這些結果暗示，在進化上高度保守的ARHGAP11A基因與動物生長發(fā)育的密切相關。

續(xù)表

基因突變與畜禽生長發(fā)育性狀密切關聯(lián)，從而常作為畜禽育種的分子標記以大幅度提高育種效率[11-13]。最為著名的是myostatin基因（也稱為GDF8基因），其SNP位點顯著影響夏洛萊肉羊的肌肉深度[14]以及新西蘭羅姆尼羊的胴體重[15]。在南江黃羊ARHGAP11A基因4 235 bp上發(fā)現(xiàn)16個SNPs，其中14個集中在最后一個外顯子（Exon 12；7個）和3′UTR（7個），并且位于轉錄調控元件內(nèi)的7個SNPs中有 4個（g.3155T＞C、g.3483A＞G、g.3525A＞G和 g.3680T＞C）在 3′UTR。大量研究表明，3′UTR 與mRNA在細胞核外的轉運、翻譯效率、穩(wěn)定性及亞細胞定位緊密相關[16]。該區(qū)域的變異會對目標基因功能的發(fā)揮產(chǎn)生一定程度的影響，如肉牛ANGPTL4基因的3′UTR SNPs位點與肉用性能顯著相關[17]。本研究在南江黃羊群體中分析了3個3′UTR內(nèi)的SNPs（g.3483A＞G、g.3525A＞G 和 g.3621G＞A），發(fā)現(xiàn)它們均與南江黃羊的體重體尺性狀密切相關。其中，在g.3483A＞G和g.3621 G＞A位點純合突變個體體重（2、6和12月齡）高于野生型。在g.3525 A＞G位點，AG型個體不同階段的體重體尺指標均高于GG型和AA型個體。

值得注意的是，在南江黃羊群體ARHGAP11A基因上發(fā)現(xiàn)7個SNPs位于轉錄調控元件基序內(nèi)，如g.3483A＞G與g.3525A＞G分別位于轉錄激活因子 IPF1（pancreatic and duodenal homeobox 1，也稱為 PDX1）和 OC-2（one cut homeobox 2）的基序內(nèi)。IPF1主要涉及能量代謝和肝臟發(fā)育，并且與FOXO1（forkhead box O1）具有互作[18]，而 g.3060T＞A 位于FOXO1基序內(nèi)，OC-2則結合在RNA聚合酶II核心增強子區(qū)域參與基因激活[19]。另外，ARHGAP11A基因在CDS區(qū)中發(fā)現(xiàn)的5個錯義突變SNPs位點可直接改變氨基酸序列。因此，在ARHGAP11A基因突變位點上，這些潛在轉錄因子的調控作用以及其CDS區(qū)內(nèi)的SNP位點與南江黃羊生長發(fā)育的關系需進一步研究。

4 結論

實驗測得山羊ARHGAP11A基因全長CDS（3 069 bp）序列和部分UTR。在南江黃羊ARHGAP11A基因外顯子和UTR內(nèi)檢測到16個SNPs，主要分布于最后一個外顯子（7個）和3′UTR區(qū)（7個）。3個3′UTR 內(nèi)的突變 （g.3483A＞G、g.3525A＞G 和 g.3621G＞A）與 3種單倍型（AAGT、AGGT 和 GGAT）均與南江黃羊的體重、體尺性狀密切相關。初步研究表明ARHGAP11A基因可作為南江黃羊生長發(fā)育性狀的候選基因。

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