長足大竹象信息素結(jié)合蛋白CbuqPBP1克隆和表達分析

楊 樺，蘇 婷，楊 偉*，楊春平，周學(xué)莉，李一平

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/四川省林業(yè)生態(tài)工程省級重點實驗室，成都 611130；2.綿陽市林業(yè)局，四川綿陽 621000）

昆蟲氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）是存在于觸角感器淋巴液中的一類水溶性蛋白質(zhì)，它與進入感器內(nèi)的氣味分子相結(jié)合，并攜帶脂溶性化合物穿過親水的淋巴液，送到嗅覺神經(jīng)末梢[1]。而昆蟲信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）屬于氣味結(jié)合蛋白中的一種，它能特異的與信息素結(jié)合，在昆蟲尋偶、交配等行為中起著關(guān)鍵作用[2]。存在于嗅覺感器腔內(nèi)的信息素結(jié)合蛋白能識別并攜帶進入感器腔的特定信息素分子到達嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體[3-4]。自從R.G.Vogt和L.M.Riddiford[5]在多音天蠶蛾Antheraea polyphemus雄蟲觸角中發(fā)現(xiàn)第一個PBPs以來，經(jīng)眾多學(xué)者的探索，陸續(xù)在鱗翅目Lepidoptera、蜚蠊目Blattodea、鞘翅目Coleoptera、膜翅目Hymenoptera等多個目幾十種昆蟲觸角中發(fā)現(xiàn)PBPs，如蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides[6]、家蠶 Bombyx mori[7]、斜紋夜蛾 Spodoptera litura[8]、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua[9]、馬德拉蜚蠊Leucophea maderea[10]、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[11]、意大利蜜蜂 Apis mellifera[12]、古銅異麗金龜Anomala cuprea[13]和東方銅綠金龜Exomala orientalis[14]等，這些基因包括 PBP1、PBP2 和 PBP3，其編碼的氨基酸序列同源性在32%～92%之間[15]。

長足大竹象Cyrtotrachelus buqueti Guerin-Meneville，又名竹橫錐大象，屬鞘翅目Coleoptera象蟲科Curculionidea彎頸象屬Cyrtotrachelus，廣泛分布于我國的四川、重慶、廣西、廣東、貴州、上海、江西等地以及越南、緬甸、泰國等東南亞國家[16-18]。長足大竹象寄主廣泛，危害箣竹屬Bambusa、綠竹屬Dendrocalamopsis、牡竹屬Dendrocalamus等28個竹種的竹筍，其幼蟲尤其喜歡蛀食楠竹Phyllostachys pubescens、慈竹 Neosinocalamus affinis、青皮竹 Bambuusa textiles、撐蒿竹 Bambusa pervariabilis、綠竹 Bambusa oldhamii等叢生竹的竹筍，是一種幼蟲生長速度快、隱蔽性強的蛀食性竹林害蟲[19-20]。一年中有11個月生活在土壤中，在地上的1個月中，約15 d生活在竹筍內(nèi)[21]。長足大竹象氣味結(jié)合蛋白相關(guān)研究目前未見報道，因此，本研究依據(jù)長足大竹象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物，克隆長足大竹PBPs基因，并采用定量PCR方法檢測了該基因在不同蟲態(tài)和雄蟲不同組織中的表達水平，以期為進一步研究該基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蟲源：在2016年7月中下旬和8月中旬長足大竹象成蟲出土盛期和幼蟲期，于四川省蘆山縣思延鄉(xiāng)銅頭村（102°91′N，30°13′E）慈竹林采集剛羽化出土未交配成蟲與幼蟲，逐頭分裝于筒形牙簽盒內(nèi)（直徑5 cm，高10 cm）。帶回實驗室，對雌、雄成蟲、幼蟲（混合齡級）以及雄蟲的觸角、頭部（去觸角）、胸部、腹部、足分別收集后，立即放入液氮中快速冷凍，并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、DNAmark DL2000，日本TaKaRa公司；Taq PCR MasterMix、大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞、氨芐青霉素、50×TAE緩沖液，天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量試劑盒及其它相關(guān)試劑，寶生物工程（大連）有限公司。

儀器：ABI step one plus熒光定量PCR儀、NANODROP RNA質(zhì)量檢測儀，美國ABI公司；PTC200 PCR擴增儀、GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀，美國伯樂（Bio-Rad）生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（美國）有限公司；DU800紫外分光光度計，BeckmanCoulter（美國）公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

取長足大竹象雄成蟲觸角10對，液氮研磨后按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書提取觸角總RNA，最后溶于50 μL去RNA降解酶水中，置于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明書操作流程，往 PCR 管中加入 2 μL 5×PrimeScript?Buffer、0.5 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT Primer（50 μmol/L）、0.5 μLRandom6mers（100 μmol/L）、4.5 μL RNase Free dH2O，最后加入 2 μL total RNA。將上述混合物于PCR儀中逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA：37°C 保溫 15 min，85 ℃失活 5 s，4 ℃保持，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增cDNA片段

根據(jù)長足大竹象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GenBank登錄號：SAMN06176790）設(shè)計特異性引物（表1）。PCR反應(yīng)體系為 25 μL：1 μL 反轉(zhuǎn)錄第一鏈 cDNA、2 μL 上下游引物、9.5 μL ddH2O、12.5 μL Premix Taq。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃C變性30 s，41.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保持。精確吸取5 μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，6×loading buffer染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 PBP基因的克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書的操作步驟進行膠回收，參照pMDTM19-T Vector說明書，配制10 μL 反應(yīng)體系：1 μL pMDTM19-T Vector，2 μL 膠回收產(chǎn)物，2 μL ddH2O，5 μL SolutionⅠ。PCR儀里16℃反應(yīng)30 min。連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化Escherichia.coli DH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍白斑篩選，挑取8個白色單菌落進行菌落PCR（反應(yīng)體系及條件同上）鑒定，鑒定為陽性克隆的樣品送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 序列分析

將獲得的序列在NCBI中進行BLAST同源性檢索，利用ORF Finder查找開放閱讀框。使用SignaIP進行信號肽預(yù)測，TMHMM進行跨膜區(qū)預(yù)測，ExPASy-ProtScale進行親脂性分析，compute pI/Mw預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點及質(zhì)量，并通過BLAST分析推導(dǎo)氨基酸序列。從NCBI查閱昆蟲PBP氨基酸序列，通過Clustalx及MEGA 5.0建立系統(tǒng)進化樹，采用Bootstrap值檢驗系統(tǒng)數(shù)的置信度，各重復(fù)1 000次。

1.2.5 長足大竹象CbuqPBP1基因的相對表達量分析

取雌、雄成蟲、幼蟲（混合齡級）以及成蟲的觸角、頭部（去觸角）、胸部、腹部、足各10 mg，分別提取總RNA，取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，每個蟲態(tài)和組織設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)長足大竹象PBP基因（GenBank登錄號：KU845733）設(shè)計特異性引物，并根據(jù)長足大竹象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GenBank登錄號：SAMN06176790）設(shè)計內(nèi)參基因引物，每個樣品重復(fù)3次（表1）。采用SYBR Green I染料法進行實時熒光定量 PCR，20 μL 反應(yīng)體系為：2×YBR?Premix Ex Taq II 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、cDNA模板 1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性40 s，95 ℃變性 10 s，57 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 20 s，45個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

長足大竹象PBP基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算[22]。采用SPSS 20.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 長足大竹象CbuqPBP1基因序列分析

根據(jù)長足大竹象轉(zhuǎn)錄組結(jié)果設(shè)計引物，提取長足大竹象成蟲觸角總RNA，用紫外分光光度計測定所提取總RNA純度，OD260/OD280為1.9，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以長足大竹象觸角的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到530 bp左右的特異性條帶，基因長度與PBP/GOBP family相符。在NCBI上經(jīng)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)此序列與鞘翅目的金龜類昆蟲PBPs一致性較高，證明獲得的序列為長足大竹象性信息素結(jié)合蛋白基因命名為CbuqPBP1（GenBank登錄號：KU845733.1）。

CbuqPBP1進行ORF預(yù)測，結(jié)果表明，CbuqPBP1基因包含1個長為432 bp的開放閱讀框，編碼143個氨基酸殘基，其中前17個氨基酸殘基為預(yù)測的信號肽，預(yù)測蛋白分子量為15.84 kDa，等電點為4.60，含有6個保守的半胱氨酸位點，具有昆蟲PBP一級結(jié)構(gòu)的典型特征，CbuqPBP1基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。

圖1 長足大竹象CbuqPBP1核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 1 Nucleotide and putative amino acid sequences of CbuqPBP1 gene from Cyrtotrachelus buqueti

將推定的CbuqPBP1氨基酸序列在TMHMM在線預(yù)測網(wǎng)站上預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有跨膜區(qū)（圖2），推測該蛋白為分泌蛋白。用J.Kyte和R.F.Doolittle[23]的方法對CbuqPBP1氨基酸序列進行親脂性分析，發(fā)現(xiàn)CbuqPBP1氨基酸序列中含有較多的親脂性氨基酸，以第70-80位和第120-140位的親脂性較強，推測其可能是CbuqPBP1與脂溶性氣味物質(zhì)的結(jié)合位點（圖3）。

2.2 長足大竹象CbuqPBP1系統(tǒng)發(fā)育分析

氨基酸序列相似性分析表明，CbuqPBP1與鞘翅目和鱗翅目17種昆蟲的27個PBPs相似性為37.68%。其中，與鞘翅目和鱗翅目昆蟲相似性分別為38.47%和52.39%（圖4）。應(yīng)用MEGA 5.0通過鄰接法對27個PBPs序列運算1 000次獲得系統(tǒng)進化樹表明，昆蟲PBPs以目聚類的趨勢明顯，主要分為鱗翅目和鞘翅目兩大分支（圖5）。目以下分支中，長足大竹象與紅銅麗金龜Anomala rufocuprea的ArufPBP2和ArufPBP3在一個亞分支上，說明PBPs聚類結(jié)果能較好的反映昆蟲間的親緣關(guān)系。

圖2 長足大竹象CbuqPBP1跨膜區(qū)預(yù)測Figure 2 Predicted transmembrane segment of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

圖3 長足大竹象CbuqPBP1氨基酸親脂性分析Figure 3 Predicted hydropathy profiles for the amino acid sequences of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

2.3 長足大竹象CbuqPBP1表達分析

長足大竹象不同蟲態(tài)和不同組織中的CbuqPBP1相對表達量見圖6。不同蟲態(tài)體內(nèi)CbuqPBP1的表達存在差異，雄蟲體內(nèi)的表達量最高，是雌蟲表達量的5倍，而幼蟲體內(nèi)的表達量最低，為雄蟲表達量的1/100。

在雄蟲各組織部位中，CbuqPBP1在觸角中的表達量最高，是頭部和胸部表達量的41.2倍和114倍，而在腹部和足上幾乎不表達。

3 討論

圖4 長足大竹象與其他昆蟲的信息素結(jié)合蛋白氨基酸序列多重比對Figure 4 Alignment of the amino acid sequences of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects

本文利用RT-PCR和TA技術(shù)，首次克隆出長足大竹象一個信息素結(jié)合蛋白基因CbuqPBP1。該基因具有昆蟲PBPs典型特征，有一個N-末端保守信號肽，具有6個保守的半胱氨酸殘基，可用Cys1-X26-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X10-Cys5-X8-Cys6表示，符合Xu Y.L.等[24]鑒別鱗翅目昆蟲PBPs的經(jīng)典模式（Cys1-X25-Cys2-X3-Cys3-X36-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6）。根據(jù) J.Kyte 和 R.F.Doolittle[23]的方法對氨基酸序列進行親脂性分析，發(fā)現(xiàn)CbuqPBP1有多個較強的親脂性區(qū)域，與已報道的苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus AlinOBP1[25]和桃蛀螟Conogethes punctiferalis CpunPBP1[26]的親脂性區(qū)域相似，推測該區(qū)域可能是脂溶性氣味分子的結(jié)合位點。同源性比較分析表明，CbuqPBP1與紅銅麗金龜ArufPBP2和ArufPBP3相似性較高，且聚在同一分支上，推測這3個基因來源同一個祖先基因，由于在長期進化過程中對不同類型環(huán)境化學(xué)因子刺激的適應(yīng)和進化使其產(chǎn)生了分化，在不同物種間行使相同或某些類似的功能[27]。

圖5 長足大竹象與其他昆蟲PBPs氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects based on amino acid sequences

圖6 長足大竹象不同蟲態(tài)和雄蟲不同組織中CbuqPBP1的相對表達水平Figure 6 Relative expression levels of CbuqPBP1 in bodies at different instars and different tissues male of Cyrtotrachelus buqueti

本研究中，CbuqPBP1在長足大竹象成蟲階段的表達量最高，幼蟲期微量表達，說明該基因在成蟲求偶過程中起著非常關(guān)鍵的作用。M.Laue和R.A.Steinbrecht[28]與 R.G.Vogt和 L.M.Riddiford[5]研究認(rèn)為PBPs只在雄蟲體內(nèi)特異性表達，而后來的研究發(fā)現(xiàn)如馬德拉蜚蠊[29]、斜紋夜蛾[8]、煙草夜蛾Heliothis assulta[30]、綠盲蝽 Apolygus lucorum[31]等昆蟲的 PBPs不僅在雄蟲體內(nèi)表達，在雌蟲體內(nèi)也有表達。這可能是雌蟲體內(nèi)的PBPs也能夠識別自身的信息素，或者至少能夠識別自身信息素復(fù)合物的某些成分[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，CbuqPBP1在雄蟲腹部和足上不表達，在觸角、頭部（去觸角）和胸部上均有表達，且在觸角上的表達量最高。張升祥[33]發(fā)現(xiàn)BmPBP1在家蠶所有組織中均有表達，BmPBP2和BmPBP3在翅和胸足有少量表達，其中，BmPBP3在脂肪體中也有少量表達，而在觸角中均有大量表達。張帥等[34]還發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲Helicoverpa armigera HarmPBP2在雌蟲下顎須內(nèi)有表達，但仍以觸角的表達量最高。說明觸角是昆蟲感知外界信息和接收性信息素的主要器官。

本研究發(fā)現(xiàn)，CbuqPBP1基因在雄蟲觸角中有較高的表達量，結(jié)合該蛋白與長足大竹象信息素類似物的競爭結(jié)合實驗結(jié)果（另文發(fā)表），推測CbuqPBP1是一個信息素結(jié)合蛋白，在長足大竹象覓偶過程中可能扮演重要角色。而長足大竹象雌性信息素包括多種組分[20]，CbuqPBP1與長足大竹象雌性信息素不同組分的結(jié)合關(guān)系目前還不清楚，需要做進一步的研究。

參考文獻：

[1]VOGTRG，CALLAHAN FE，ROGERSME，etal.Odorantbinding protein diversity and distribution among the insect orders，as indicated by LAP，an OBP-related protein of the true bug Lygus lineolaris（Hemiptera，Heteroptera）[J].Chemical Senses，1999，24（5）：481-495.

[2]KRIEGER J，BREER H.Olfactory reception in invertebrates[J].Science，1999，286：720-723.

[3]Hansson BS.Olfaction in Lepidoptera[J].Experientia，1995，51（11）：1003-1027.

[4]修偉明，董雙林，王蔭長.信息素結(jié)合蛋白及其分子運輸機制和生理功能研究進展[J].昆蟲學(xué)報，2005，48（5）：778-784.

[5]VOGT R G，RIDDIFORD L M.Pheromone binding and inactivation by moth antennae[J].Nature，1981，293（5828）：161-163.

[6]DE SANTIS，F(xiàn)RANCOIS M C，MERLIN C，et al.Molecular cloning and in situ expression patterns of two new pheromone-binding proteins from the corn stemborer，Sesamia nonagrioides[J].Journal of Chemical Ecology，2006，32（8）：1703-1717.

[7]FORSTNER M，GOHL T，BREER H，et al.Candidate pheromone binding proteins of the silk moth Bombyx mor[iJ].InvertNeurosci，2006，6（4）：177-187.

[8]XIU W M，ZHOU Y Z，DONG S L.Molecular characterization and expression pattern of two pheromone-binding proteins from Spodoptera litura （Fabricius）[J].Journal of Chemical Ecology，2008，34（4）：487-498.

[9]XIU W M，DONG S L.Molecular characterization of two pheromone binding proteins and quantitative analysis of their expression in the beet armyworm，Spodoptera exigua Hübne[rJ].JournalofChemical Ecology，2007，33（5）：947-961.

[10]LARTIGUE A，GRUEZ A，SPINELLI S，et al.The crystal structure of a cockroach pheromone-binding protein suggests a new ligand binding and releasemechanism[J].Journal of Biological Chemistry，2003，278：30213-30218.

[11]KRUSE S W，ZHAO R，SMITH D P，et al.Structure of a specific alcohol-binding site defined by the odorant binding protein LUSH from Drosophila melanogaster[J].Nature Structural Biology，2003，10（9）：694-700.

[12]LARTIGUE A，GRUEZ A，BRIAND L，et al.Sulfur-SAD crystal structure of a pheromone binding protein from the honeybee Apis mellifera L[J].Journal of Biological Chemistry，2004，279：4459-4464.

[13]NIKONOV A A，PENG G，TSURUPA G，et al.Unisex pheromone detectors and pheromone binding proteins in scarab beetles[J].Chemical Senses，2002，27（6）：495-504.

[14]PENG G，LEAL W S.Identification and cloning of a pheromonebinding protein from the oriental beetle，Exomala orientalis[J].Journal of Chemical Ecology，2001，27（11）：2183-2192.

[15]ABRAHAM D，LFSTEDT C，PICIMBON J F.Molecular characterization and evolution of pheromone binding protein genes in A－grotis moths[J].Insect Biochemistry&Molecular Biology，2005，35（10）：1100-1111.

[16]蕭剛?cè)?中國森林昆蟲[M].北京：中國林業(yè)出版社.1992：580-581.

[17]徐天森，王浩杰.中國竹子主要害蟲[M].北京：中國林業(yè)出版社.200：475-78.

[18]鞠瑞亭，夏翠華，徐俊華，等.上海地區(qū)長足大竹象初報[J].中國森林病蟲，2005，24：7-9.

[19]王維德，王雄清，陳封政.沐川縣竹林主要害蟲大竹象的調(diào)查[J].樂山師范學(xué)院學(xué)報，2002，17（4）：49-50.

[20]忙定澤，羅慶懷，舒敏，等.長足大竹象成蟲體表信息化學(xué)物質(zhì)的提取和鑒定[J].昆蟲學(xué)報，2012，48（3）：291-302.

[21]王維德，陳封政，王雄清.長足大竹象繁殖行為的初步研究[J].四川動物，2005，24（4）：540-541.

[22]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[23]KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].Journal of Molecular Biology，1982，157（1）：105-132.

[24]XU Y L，HE P，ZHANG L，et al.Large-scale identification of odorant-binding proteins and chemosensory proteins from expressed sequence tags in insects[J].BMC Genomics，2009，10（1）：632-644.

[25]谷少華，張學(xué)瑩，張永軍，等.苜蓿盲蝽氣味結(jié)合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表達譜分析[J].昆蟲學(xué)報，2010，53（5）：487-496.

[26]賈小儉，郝少東，杜艷麗，等.桃蛀螟性信息素結(jié)合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表達譜及其與配體化合物的結(jié)合特性分析[J].昆蟲學(xué)報，2015，58（11）：1167-1176.

[27]紀(jì)萍，劉靖濤，谷少華，等.綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP7的表達及氣味結(jié)合特性[J].昆蟲學(xué)報，2013，56（6）：575-583.

[28]LAUE M，STEINBRECHT R A.Topochemistry of moth olfactory sensilla[J].International Journal of Insect Morphology and Embryology，1997，26（3）：217-228.

[29]RIVIèRE S，LERTIGUE A，QUENNEDEY B，et al.A pheromonebindingprotein from thecockroach Leucophaea maderae：cloning，expressionandpheromonebinding[J].BiochemicalJournal，2003，371（2）：573-579.

[30]GY?RGYI T K，ROBY-SHEMKOVITZ A J，LEMER M R.Characterization and cDNA cloning of the pheromone-binding protein from the tobacco hornworm，Manduca sexta：a tissue-specific developmentally regulated protein[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1988，85（24）：9851-9855.

[31]JI P，GU S H，LIU J T，et al.Identification and expression profile analysis of odorant-binding protein genes in Apolygus lucorum（Hemiptera：Miridae）[J].Applied Entomology and Zoology，2013，48（3）：301-311.

[32]CALLAHAN F E，VOGT R G，TUCKER M L，et al.High level expression of"male specific"pheromone binding proteins（PBPs）in the antennae of female noctuid moths[J].Insect Biochemistry&Molecular Biology，2000，30（6）：507-514.

[33]張升祥.家蠶氣味結(jié)合蛋白基因的研究[D].濟南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[34]張帥，張永軍，蘇宏華，等.棉鈴蟲信息素結(jié)合蛋白2 cDNA的克隆、表達與組織特異性表達[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2359-2365.