大鼠血清外泌體對MCF-7細(xì)胞自噬的影響

陳 奇，徐 彬，毛建文*

（1．廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2．廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

1963年，比利時(shí)的細(xì)胞學(xué)家克里斯汀德迪夫率先提出了一個(gè)術(shù)語“自噬”，即一種由細(xì)胞自身調(diào)控的毀滅機(jī)制，用來降解無用或功能失調(diào)的組份[1]。大隅良典于90年代闡明了細(xì)胞自噬的機(jī)制，研究者們直至此時(shí)才發(fā)現(xiàn)自噬在人體中的重要作用[2]。外泌體是一種細(xì)胞來源的囊泡，存在于許多乃至所有真核生物的體液中，包括血液、尿液以及細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液中[3-4]。幾乎所有類型的細(xì)胞都通過自噬克服饑餓、回收養(yǎng)分以及將多余的或有害的成分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。同時(shí)外泌體能夠在細(xì)胞間傳遞，因此在某些情況下這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程是通過外泌體進(jìn)行的[5]。目前關(guān)于血清外泌體的研究大多集中于作為新的生物標(biāo)志物用于活體檢驗(yàn)方面，對于血清外泌體與腫瘤及自噬之間的研究較少。本研究觀察了大鼠正常血清外泌體對乳腺癌（MCF-7）細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7；高糖DMEM培養(yǎng)基；四季青胎牛血清；胰島素（Sigma公司）；胰酶；雷帕霉素（Rapamycin）；CCK-8試劑盒、LC3B抗體、GAPDH抗體、鼠抗、兔抗（碧云天公司）；脫脂奶粉

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及血清外泌體提取及鑒定

MCF-7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液（含10 %胎牛血清、0.01 mg/ml胰島素）培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。取1 ml正常SD大鼠血清，試劑盒法提取，用PBS重懸至200 μl，加入DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)液，配置成每100 μl培養(yǎng)液含10 μl外泌體，0.22 μm微孔濾膜過濾。對所提取的血清外泌體采用透射電鏡檢測其形態(tài)特征，采用WB法鑒定特征性蛋白質(zhì)。

1.3 血清外泌體對MCF-7細(xì)胞存活率的影響觀察

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化，按4×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為Control、雷帕霉素（Rapa）、外泌體（Exo）、Exo+Rapa組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。Control組不加任何藥物培養(yǎng)；Rapa組加入30nM Rapa，作用24 h；Exo組加入過濾后的含10%外泌體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h；Exo+Rapa組先加入含10%外泌體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，然后加入30 nM Rapa，作用24 h。處理結(jié)束后使用CCK-8試劑盒，孵育1 h，檢測450 nm波長處的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均值。

1.4 MCF-7細(xì)胞LC3B的熒光檢測

細(xì)胞分組同1.3。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，固定15 min。去除固定液，洗滌后加入封閉液，37℃下封閉1 h。加入LC3B抗體（1:100）4℃孵育過夜，移除抗體洗滌后加入綠色DyLight 488熒光二抗，37℃孵育1 h，洗滌后加入DAPI染核，加入抗熒光淬滅劑，封片。用熒光顯微鏡觀察，在相同曝光時(shí)間下拍照。

1.5 MCF-7細(xì)胞LC3B蛋白檢測

細(xì)胞分組同1.3。采用Western blotting法，提取MCF-7細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，5%奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗滌后加入一抗（LC3B，1:1000；GAPDH，1:1000）4℃孵育過夜。洗滌后加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h。使用ECL進(jìn)行顯影，用Image J分析軟件定量分析目的條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體的分離鑒定

血清外泌體在透射電鏡下呈茶托樣、雙分子層結(jié)構(gòu)。Western blotting法結(jié)果顯示，試劑盒提取的血清外泌體具有標(biāo)志性的CD63及HSP70蛋白。

2.2 MCF-7細(xì)胞存活率的比較

Control、Rapa、Exo及Exo+Rapa組的OD值分別為0.367±0.043、0.345±0.031、0.650±0.051、0.420±0.020。結(jié)果顯示，雷帕霉素對MCF-7細(xì)胞的生長有一定影響，但抑制作用并不明顯，血清外泌體則明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖。

2.3 MCF-7細(xì)胞LC3B表達(dá)的熒光結(jié)果比較

如圖1所示，顆粒狀綠色熒光為自噬標(biāo)志性蛋白LC3B。Control組中，MCF-7細(xì)胞有少量的自噬現(xiàn)象；Rapa組中，由于加入自噬誘導(dǎo)劑，細(xì)胞的自噬顯著增多；而Exo組的細(xì)胞自噬現(xiàn)象與正常對照組相比更少，幾乎無自噬現(xiàn)象；至于Exo+Rapa組的細(xì)胞則與Control組相類似。

圖1 MCF-7細(xì)胞LC3B表達(dá)的熒光結(jié)果比較

2.4 MCF-7細(xì)胞中LC3B的相對表達(dá)量比較

LC3B 2與LC3B 1比值的大小通常用于估計(jì)自噬水平的高低，比值越大則自噬水平越高。Control、Rapamycin、Exo、Exo+Rapa組LC3B2/LC3B1的比值分別為1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496。結(jié)果顯示，Exo組與Rapa組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Exo+Rapa組與Rapa組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。外泌體能夠降低MCF-7細(xì)胞的自噬且能抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬。見表2。

圖2 MCF-7細(xì)胞LC3B的相對表達(dá)量比較

3 討 論

乳腺癌時(shí)至今日仍是發(fā)展中國家女性癌癥死亡的主要原因，在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率亦居高不下[6]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是一種重要的信號分子，參與細(xì)胞通訊，在免疫應(yīng)答和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[7]?，F(xiàn)階段的研究大多集中于腫瘤分泌的外泌體對癌癥的發(fā)展[8]、轉(zhuǎn)移[9,10]、化學(xué)耐藥[11]等多方面的影響。對于血清外泌體的研究則多為生物標(biāo)志物[12]，其對腫瘤會(huì)產(chǎn)生何種影響仍未可知。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清外泌體能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬。而自噬與癌癥緊密相關(guān)，并在腫瘤中起雙重作用，能夠抑制腫瘤發(fā)生但對腫瘤生長又有著促進(jìn)作用[13-16]。那么血清外泌體是否能通過抑制腫瘤細(xì)胞的自噬，從而抑制腫瘤的生長呢，其抑制自噬的機(jī)制又是什么，以及血清外泌體是怎樣從血液進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中的？這些問題值得進(jìn)一步深入的探討?？偠灾?，本研究的發(fā)現(xiàn)，為抑制腫瘤生長提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，為血清外泌體的功能研究開拓了新的方向。

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