液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中6種酰胺類農(nóng)藥的殘留量

高海榮

酰胺類農(nóng)藥是目前市場上應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥，主要是通過抑制琥珀酸脫氫酶的活性，使病菌失去活性，而達到滅菌的目的[1-2]。現(xiàn)多用于對瓜果蔬菜耕種期的殺菌和儲藏期的防霉[3]，相對于酰胺類的除草劑和殺蟲劑，酰胺類的殺菌劑毒性低、藥量小，在生活中應(yīng)用更為普遍。但隨著普及，酰胺類殺菌劑的代謝殘留問題引起了人們的關(guān)注，目前市場上最常見的酰胺類藥物有16個品種[4-5]，環(huán)丙酰胺、萎銹靈、腈菌胺、氟酰胺、噻唑菌胺、氧化萎銹靈、滅銹胺、硅噻菌胺、噻酰菌胺、噻呋酰胺、環(huán)酰菌胺、氟吡菌胺、雙氯腈菌胺、環(huán)氟菌胺、氟酰菌胺、環(huán)啶菌胺。不同的國家對酰胺類殺菌劑在瓜果蔬菜中的最大殘余量均有著嚴格的規(guī)定，以甲霜靈為例，歐盟規(guī)定甲霜靈最大殘余量在0.05～2.00 mg/kg[6]，日本則將其定義在0.05～4.00 mg/kg[7]，而美國則規(guī)定應(yīng)在0.10～15 mg/kg[8]，中國香港則認為應(yīng)在0.05～10.00 mg/kg[9]，我國大陸地區(qū)則規(guī)定在0.05～5.00 mg/kg[10-12]。

目前，對酰胺類農(nóng)藥的監(jiān)測多采用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等，通過監(jiān)測一種或一種以上的酰胺類農(nóng)藥的殘余量，來進行綜合判斷，多瓜果蔬菜中的多種酰胺類農(nóng)藥進行監(jiān)測的報道較為少見，本文通過使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對啶酰菌胺、環(huán)氟菌胺、氟啶酰菌胺、嘧菌胺、雙炔酰菌胺、硅噻菌胺的農(nóng)藥殘留余量進行測定，以了解其靈敏度情況和抗干擾情況。

1 方法

1.1 使用儀器

儀器設(shè)備：液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）（Waters公司）/液相色譜系統(tǒng)（Waters公司）；低速臺式離心機和微量離心機（Sigma公司）；固相萃取裝置（Agela公司）；渦旋混勻器（IKA公司）；超純水凈化系統(tǒng)（Pall公司）；電子天平（Mettler公司）。

材料試劑：甲醇、乙腈、甲苯、乙酸銨、甲酸、Florisil固相萃取柱、95%二氯甲烷-5%甲醇溶液、乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）填料、C18-H（17%）填料、NaCl、0.22微米濾膜（Pall公司）。

啶酰菌胺、環(huán)氟菌胺、氟啶酰菌胺、嘧菌胺、雙炔酰菌胺、硅噻菌胺標準物質(zhì)（Sigma公司）。

1.2 實驗方法

標準溶液的配制：稱量0.01 g標準物質(zhì)，加入10 ml乙腈進行溶解，配制為1 mg/ml濃度的儲備液，再用移液管吸取適量的儲備液，加入乙腈，配制為10 mg/L的中間溶液，可再根據(jù)需要配備其他濃度的標準溶液。

色譜條件：色譜柱：C18=200 mm×4.6 mm，粒徑3.0 μm；流動相：純水（A相）及乙腈（B相），柱溫：30℃，流速200 μl/min；進樣量：1.0 μl。進行梯度脫洗：0～ 4 min，B相20% ～ 50%，5～ 13 min，B相 50% ～ 70%。14～ 16 min，80%，15～ 15.05 min，B相 80% ～ 20%，15.05 min，B相20%。

質(zhì)譜條件：電離+6種酰胺類農(nóng)藥，離子源：可加熱的ESI源，掃描方式，正離子掃描，檢測方式：MRM，噴霧電壓：3 000 V，輔助氣（N2）壓力：55.0 MPa；毛細管溫度：300℃，離子源溫度：300℃，其他質(zhì)譜條件見表1。

樣品的提取與凈化：使用準確精度為0.001 g的電子天平，稱量20 g已均質(zhì)樣品，放入250 ml的離心管中，加入20 ml乙腈和3～5 g NaCl，渦旋混勻，進行離心。在室溫下靜置1 h，取10 ml離心后的上清液，用氮氣吹干，殘余物用95%二氯甲烷-5%甲醇溶液進行溶解，完成提取過程。接著將樣品轉(zhuǎn)移至Florisil固相萃取柱（用95%二氯甲烷-5%甲醇活化Florisil固相萃取柱，并分三次清洗樣品瓶），將清洗后的液體均轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，接收所有的流出液，用氮氣吹干，再用5 ml甲醇復溶，過0.22 μm有機相濾膜，用以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定。

表1 化合物質(zhì)譜采集離子信息

表2 6種農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

1.3 測定基質(zhì)效應(yīng)

樣品完成提取和凈化后，配制純?nèi)軇z測液和空白基質(zhì)檢測液，在同一色譜條件下測定基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)用響應(yīng)值計算公式：Mi=（Ami-Asi）/Asi×100。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化質(zhì)譜調(diào)節(jié)

對1.0 mg/L待測化合物的單標準溶液以流動注射的方式進行母離子全掃描，結(jié)果顯示在正離子化模式下6種殺菌劑均可形成穩(wěn)定的[M+H]+，經(jīng)過一級質(zhì)譜優(yōu)化，確定噴霧電壓等質(zhì)譜參數(shù)，通過二級掃描，優(yōu)化子離子等參數(shù)，選取1個母離子及其對應(yīng)的4個子離子，在含基質(zhì)的條件下掃描，最終選擇兩個靈敏度高且受到干擾影響小的離子，以強度較高的為定量離子，見表1。

2.2 優(yōu)化色譜條件

目標化合物與樣品雜質(zhì)有效分離是降低基質(zhì)效應(yīng)的有效手段，本次采用C18色譜柱，相同條件下與超高壓色譜柱相比，該色譜柱的柱壓下降40%～45%，本研究采用兩次梯度進行脫洗，使得基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，6種酰胺類藥物均得到了基線分離，見圖1。

2.3 凈化方法的選擇

目前對于瓜果蔬菜中酰胺類農(nóng)藥殘留，常用的是QuEChERS法，但是其凈化效果差，可能會產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)，本次實驗選取葡萄、黃瓜、白菜等10種基質(zhì)，分別采用改進QuEChERS法和Florisil固相萃取法進行比較，評價凈化效果。見圖2和圖3，可知經(jīng)過Florisil凈化后，目標物的基質(zhì)效應(yīng)降低，回收率在86%～106%。

2.4 線性范圍與檢出限

將6種殺菌劑混合標準溶液進行稀釋，質(zhì)量濃度為0.5 μg/L、5 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L，以定量離子對的峰面積為縱坐標、各酰胺類殺菌劑組分濃度為橫坐標繪制標準曲線，結(jié)果表明，目標物質(zhì)量濃度在0.5～100 μg/L的范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，見表2。

2.5 方法回收率及精密度

根據(jù)前文建立的方法，以葡萄、黃瓜、白菜等10種基質(zhì)種分別添加5 μg/L混合標準溶液0.5 ml、1.0 ml，進行回收率試驗，結(jié)果可知評價回收率在65%～125%，見表3。

3 結(jié)論

本次通過乙腈提取，F(xiàn)lorisil固相萃取柱凈化，建立了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對瓜果蔬菜中啶酰菌胺、環(huán)氟菌胺、氟啶酰菌胺、嘧菌胺、雙炔酰菌胺、硅噻菌胺標準物質(zhì)，共6種酰胺類農(nóng)藥的殘余量的測定，其可靠性高、靈敏度強、測量準確，平均回收率在平均回收率在65%～125%，滿足了歐盟、日本等國家對于6種酰胺類農(nóng)藥在瓜果蔬菜中的殘余量的要求（0.01 mg/kg），對于我國瓜果蔬菜的順利出口有了定量測量的標準，為農(nóng)產(chǎn)品的殘留監(jiān)測技術(shù)提供了參考和依據(jù)。

圖1 目標物的總離子流圖及各化合物的質(zhì)譜圖

圖2 改良QuEChERS法凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

圖3 Florisil固相萃取法凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

表3 10種樣品中酰胺類殺菌劑的加標回收率和相對標準偏差

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