甲烷氧化菌生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的研究進展

江 梅，辛嘉英，，鄧曉萍，林惠穎，夏春谷，陳書明

（1.哈爾濱商業(yè)大學 食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801）

甲烷是一種來自自然和人類排放的無色無味氣體，通過燃燒可以提供能量或熱量。將甲烷排放到大氣中會帶來負面影響，因為它是一種溫室氣體，甲烷的溫室效應約是等量二氧化碳的20多倍。在全球甲烷排放中，人類活動排放的甲烷占大部分，約為63%，其余為自然生物排放的甲烷［1］。人為的甲烷排放主要是使用化石燃料、畜牧業(yè)填埋和生物質(zhì)燃燒產(chǎn)生的。天然的甲烷主要來源于濕地、海洋、河流、湖泊、永久凍土、天然氣水合物、野火、植被、陸地節(jié)肢動物和野生動物等［2］。

甲烷氧化菌是能夠利用甲烷作為唯一碳源和能源生長的細菌［3］，可以在氧氣的作用下催化甲烷等低碳烷烴或烯烴進行羥基化或環(huán)氧化反應，并生成有用的代謝產(chǎn)物。將低溶解度的氣體作為碳源是一大挑戰(zhàn)，但甲烷氧化菌在以甲烷作為碳源時能產(chǎn)生巨大的價值。雖然人們對甲烷氧化菌已進行了深入的研究，但還未有全面討論甲烷氧化菌的潛在生物技術應用的報道。

本文主要對甲烷氧化菌的代謝產(chǎn)物及其應用現(xiàn)狀和前景進行了綜述和展望。

1 甲烷氧化菌

從生物學的角度，甲烷氧化菌是利用甲烷作為唯一碳源和能源的革蘭氏陰性細菌，它可以將甲烷轉化為細胞內(nèi)化合物或通過與其他微生物相互作用將甲烷轉化為一種底物?；诩淄榈耐緩胶蜕硖卣鳎?-5］，甲烷氧化菌分為Ⅰ型（5-磷酸核酮糖途徑），Ⅱ型（絲氨酸途徑）和X型（5-磷酸核酮糖途徑和絲氨酸途徑）。Ⅰ型甲烷氧化菌包括Methylomonas，Methylobacter，Methylomicrobium，Methylosphaera，Methylocaldum等，它們利用5-磷酸核酮糖途徑來代謝甲醛；Ⅱ型甲烷氧化菌如Methylosinus和Methylocystis則依靠絲氨酸途徑實現(xiàn)碳同化；X型甲烷氧化菌，如Methylococcus，可以使用上述兩種代謝途徑，但它們主要依賴于5-磷酸核酮糖途徑并且生長繁殖溫度比Ⅰ型或Ⅱ型甲烷氧化菌高。甲烷氧化菌通過把甲烷轉化為生物質(zhì)、二氧化碳和生物聚合物（碳儲存），實現(xiàn)了生物法去除甲烷［6］。

2 甲烷氧化菌的碳代謝途徑

甲烷單加氧酶（MMO），包括可溶性甲烷單加氧酶（sMMO）和顆粒狀或膜結合甲烷單加氧酶（pMMO），是甲烷代謝途徑的關鍵酶之一，可將甲烷催化氧化為甲醇。甲烷氧化菌在氧氣的作用下先將甲烷催化氧化為甲醇，然后在甲醇脫氫酶的作用下催化氧化為甲醛，再通過絲氨酸途徑或5-磷酸核酮糖途徑在細胞內(nèi)合成生物質(zhì)，最后在甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的作用下將甲醛催化氧化為甲酸再進一步氧化成CO2和H2O，并為細胞的生長代謝提供煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。甲烷氧化菌的碳代謝途徑如圖1所示。

圖1 甲烷氧化菌的碳代謝途徑［7］Fig.1 Carbon metabolic pathway of methanotrophs［7］.

3 甲烷氧化菌代謝產(chǎn)物的應用

3.1 飼料添加劑

飼料蛋白的缺乏是許多國家仍未解決的問題，導致禽類工廠和育肥農(nóng)場效率低下［8］。以甲烷氧化菌為菌種、天然氣為碳源生產(chǎn)的單細胞蛋白，經(jīng)干燥濃縮后蛋白含量為40%～85%（w），貯藏時間長，可用于不同的動物飼料中［9］。甲烷蛋白中蛋白質(zhì)和必需氨基酸的組成和含量與魚粉和大豆粉相當，且比小麥面包等植物產(chǎn)品有一定的優(yōu)勢，甲烷單細胞蛋白的生產(chǎn)是微生物自然發(fā)酵的過程，操作簡單，不受氣候條件的影響。微生物生長繁殖速度快，生產(chǎn)效率高，繁殖速度比動植物高上萬倍。在發(fā)酵過程中，采用天然氣，以純氧氣和氨為氮源、磷酸為磷源，并補充其他礦物質(zhì)，控制pH=6.5，在45 ℃下運行。將濃縮的生物質(zhì)快速加熱至140 ℃滅菌，然后緩慢冷卻，使細胞裂解產(chǎn)生蛋白質(zhì)。甲烷氧化菌生產(chǎn)的甲烷蛋白不含其他致病菌，也沒有致敏性，安全無害，并且還含有多種維生素、碳水化合物、脂類、礦物質(zhì)等［10］以及豐富的酶類和生物活性物質(zhì)，如輔酶A、輔酶Q、谷胱甘肽和麥角固醇等，營養(yǎng)價值優(yōu)于魚粉和大豆粉，可以將其用作飼料的蛋白質(zhì)補充劑。

Skrede等［11-12］研究發(fā)現(xiàn)，將甲烷蛋白取代豆粕和魚粉作為飼料添加到肉雞和仔豬的日糧中，可以改善和提高肉制品冷凍貯藏下的感官質(zhì)量和穩(wěn)定性。同時，甲烷蛋白作為飼料可以改善豬肉的脂肪質(zhì)量，降低冷凍儲藏中豬肉的脂質(zhì)氧化速率，提高肉的保藏品質(zhì)和感官質(zhì)量；同時也減少了肉雞儲藏過程中脂肪類物質(zhì)的氧化［13-14］。動物實驗及化學分析結果表明，甲烷蛋白是安全無害的，是理想的飼料添加劑［15］。目前，甲烷蛋白已經(jīng)用作幾種單胃動物的蛋白質(zhì)來源，包括豬、肉雞、貂、狐貍、大西洋鮭魚、虹鱒魚和大西洋比目魚等［16］。

3.2 生物驅銅劑

甲烷氧化菌素（Mb）是一種由甲烷氧化菌產(chǎn)生的具有極高銅親和力的蛋白活性肽。當其被誘導生成后，不僅可阻止機體對外源性銅的吸收，而且能與從組織進入腸黏膜的內(nèi)源銅結合，然后隨腸黏膜脫落將銅排出體外，使糞銅排出量增加，起到排銅作用。2011年，Balasubramanian等［17］拿到了發(fā)酵介質(zhì)中Mb結合銅離子后以Mb-Cu形式進入細胞的直接證據(jù)。Mb可迅速有效地消耗肝臟線粒體、細胞、組織中銅的積累，通過Mb短期治療可有效逆轉肝銅積累急性期線粒體的損傷和肝損傷［18］。這種有益的作用與肝細胞線粒體銅的消耗有關。此外，Mb治療能預防肝細胞的死亡以及隨后產(chǎn)生的肝衰竭和機體的死亡。針對急性肝炎和突發(fā)性肝功能衰竭的Wilson病患者，Mb能較高程度地消耗線粒體、細胞和整個組織水平積累的銅，且不會產(chǎn)生細胞毒性和線粒體功能障礙，同時使神經(jīng)系統(tǒng)體征得到一定程度的改善。這些結果表明，Mb具有治療急性Wilson病的潛力。但在Mb的實際發(fā)酵過程中，Mb的高效發(fā)酵制取仍存在兩個關鍵性問題：一是在發(fā)酵過程中Mb的不穩(wěn)定性問題；二是發(fā)酵過程受到二氧化碳的抑制，甲烷與氧氣的體積比導致的安全性問題。目前，研究者正尋求通過共培養(yǎng)微生物復合體系獲得穩(wěn)定優(yōu)勢的Mb產(chǎn)率。這一研究提出了新型細菌共培養(yǎng)模式［19］，通過采用光合細菌和甲烷氧化菌二元培養(yǎng)方式把甲烷和二氧化碳轉化為生物質(zhì)。

對于在一個完整系統(tǒng)中同時捕獲二氧化碳和甲烷，光合自養(yǎng)生物和甲烷氧化菌的共培養(yǎng)模式是一種獨一無二和有希望的選擇［20］。共培養(yǎng)是基于耦合在有氧光合作用和甲烷氧化之間的強大代謝作用。最重要的是，細菌使用這種共培養(yǎng)模式服從代謝工程，用可再生的甲烷和二氧化碳原料生產(chǎn)不同的生物產(chǎn)物，這種共培養(yǎng)模式比單一微生物發(fā)酵更加靈活和易操控。采用混合菌培養(yǎng)的方法將甲烷氧化菌與光合作用細菌（藍細菌）相結合，制備出安全穩(wěn)定的生物反應器，再建立一個僅需通入甲烷即可完成甲烷氧化菌生長需求的新型發(fā)酵罐，可實現(xiàn)Mb的穩(wěn)定生產(chǎn)，并最終實現(xiàn)Mb的發(fā)酵、富集和分離一體化。

3.3 化學品

3.3.1 聚羥基脂肪酸

甲烷氧化菌能利用甲烷進行生長，并在細胞內(nèi)合成大分子聚合物聚羥基脂肪酸（PHA），這些生物聚合物在細胞內(nèi)合成并沉積成顆粒，可用作碳、能量或還原能力的來源。在特殊情況下，這些生物聚合物可以占微生物干重的90%。作為一種天然高分子生物聚合物，PHA具有生物可降解性、生物相容性、無刺激性和熱塑性等特殊性能，在醫(yī)藥、工業(yè)、包裝、農(nóng)業(yè)等領域有著廣闊的應用前景，從20世紀80年代開始日益受到人們的關注和重視。聚β-羥基丁酸（PHB）是最有可能替代傳統(tǒng)塑料的一種綠色環(huán)保的生物塑料，具有廣闊的市場前景。甲烷氧化菌利用甲烷合成PHA不僅可大幅降低塑料的生產(chǎn)成本，同時也減少了溫室氣體的排放。

通過在某種營養(yǎng)限制條件下，將甲烷氧化菌的培養(yǎng)物暴露于過量的碳來誘導PHA的積累［21］。PHA的產(chǎn)量和質(zhì)量受pH、溫度、其他碳源的可用性、甲烷、氧氣、二氧化碳、大量營養(yǎng)素（氮、磷、硫、鉀、鎂、鈉）和微量金屬（銅，鐵，鋅，錳，鈷）的影響。在以天然氣為甲烷氧化菌生長碳源的氣泡式生物反應器中，PHB的產(chǎn)量可以達到細胞干重的50%，為PHB的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條可行的途徑［22］。值的注意的是，在PHB的生物合成中除了要提高PHB的產(chǎn)量外，還要控制PHB的相對分子質(zhì)量，因為PHB的相對分子質(zhì)量直接關系到它的商業(yè)價值和使用性質(zhì)。除了甲烷氧化菌的生理特性會影響PHB的相對分子質(zhì)量外，培養(yǎng)條件如pH、碳源種類和濃度以及等離子的濃度也會影響細胞內(nèi)PHB的相對分子質(zhì)量［23-25］。因此，在PHB的工業(yè)化生產(chǎn)中，控制好培養(yǎng)條件對其產(chǎn)量及質(zhì)量至關重要。

3.3.2 細胞外聚合物

工業(yè)多糖通常來自藻類和植物，為了資源的有效利用和循環(huán)利用，目前正在積極尋找可使用可再生原料的生產(chǎn)方法，而甲烷氧化菌正滿足要求。甲烷氧化菌可以使用甲烷作為唯一的碳源和能源合成細胞外多糖（EPS）［26］。許多甲烷氧化菌（Methylomonas和 Methylococcus） 和 甲 基 細 菌（Methylobacillus，Methylophaga和Xanthobacter）利用甲烷和甲醇使用C1代謝的核酮糖單磷酸途徑和核酮糖二磷酸途徑合成了EPS。值的注意的是，可以通過改變培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件來調(diào)節(jié)EPS產(chǎn)量［27］。目前已經(jīng)開發(fā)出了微生物合成EPS的實驗室方法，這有助于在某些分支行業(yè)（石油開采和紙板生產(chǎn)等）中使用。該方法將細菌生物量的產(chǎn)量提高了25%（在含有甲醇和碳酸氫鹽的培養(yǎng)基中生長）。有趣的是，在這種情況下二氧化碳的作用不僅限于底物，它也可以作為影響甲醇中碳轉化特性的調(diào)節(jié)因子。甲醇和二氧化碳比例的變化會影響蛋白質(zhì)和EPS產(chǎn)率，碳酸氫鈉部分替代甲醇會降低產(chǎn)品的凈成本和整個生產(chǎn)成本［28］。

3.3.3 甲醇、甲醛和有機酸

可溶性代謝中間體，如甲醇、甲醛和有機酸都是來自甲烷氧化菌的潛在產(chǎn)品，具有多種工業(yè)用途且每年有大量的需求。由于甲醇比甲烷更易于運輸，因此甲烷在環(huán)境溫度和壓力下有效地轉化為甲醇將具有更大的益處。甲醇是在將甲烷轉化為二氧化碳期間形成的第一個中間體。在甲烷氧化菌的代謝途徑中，甲醇迅速轉化為甲醛，意味著控制發(fā)酵過程對于積累甲醇至關重要。Tabata等［29］最初不能用甲烷氧化菌生產(chǎn)細胞外甲醇，因為甲醇脫氫酶在內(nèi)部迅速將其氧化。而當他們使用環(huán)丙烷選擇性抑制甲醇脫氫酶時檢測到了細胞外甲醇。Han等［30］還通過使用相對常見的介質(zhì)（如磷酸鹽、NaCl、NH4Cl或乙二胺四乙酸）選擇性地抑制甲醇脫氫酶實現(xiàn)了部分甲烷氧化生成甲醇。在用硅膠管制成的5 L膜通風反應器中，用高密度細胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)50 h后甲醇質(zhì)量濃度可以達到1.1 g/L［31］。研究結果表明，認真篩選生產(chǎn)菌株對甲醇的生產(chǎn)至關重要，因為來自不同分離株的甲醇產(chǎn)率和產(chǎn)量具有很大的差異，通過改變和優(yōu)化培養(yǎng)條件可以提高甲醇在培養(yǎng)液中的濃度。目前，國內(nèi)關于這方面的研究較少，而且改變培養(yǎng)條件對甲烷氧化菌積累甲醇有很大的影響，因此，控制好培養(yǎng)條件對積累甲醇至關重要。甲醛和甲酸是在礦化過程中形成的中間產(chǎn)物［7］，當前產(chǎn)量非常低。雖然甲醛等產(chǎn)品的全球需求量很大，但由于蛋白質(zhì)交聯(lián)可能使細胞甚至整個酶系不起作用，因此甲醛對細胞有一定毒性，通常只用作固定劑。一個潛在的替代方案是使用小分子催化劑模擬甲醇脫氫酶的活性位點將甲醇轉化為甲醛。

3.3.4 環(huán)氧丙烷

環(huán)氧丙烷是一種重要的基礎化工原料，主要用于聚氨酯塑料、不飽和樹脂和表面活性劑的生產(chǎn)［32］。環(huán)氧丙烷的工業(yè)化生產(chǎn)是以丙烯為原料，主要采用兩種方法：氫氯化和氧化。2004年，世界生產(chǎn)的環(huán)氧丙烷中約有一半是通過氯代醇技術生產(chǎn)的，另一半是通過氧化途徑。這些方法不僅耗能高、污染環(huán)境，而且產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品，而甲烷氧化菌可以直接利用空氣作氧化劑催化氧化丙烯生成環(huán)氧丙烷。該過程僅需一步完成，操作簡單，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本且對環(huán)境有利。與目前化學工業(yè)中所使用的方法相比，甲烷氧化菌催化丙烯生產(chǎn)環(huán)氧丙烷的方法轉化率高，環(huán)境友好，具有應用潛力［33］。但該方法也存在一些問題，甲烷氧化菌主要利用MMO催化丙烯生成環(huán)氧丙烷，而有活性的MMO穩(wěn)定性差、純化過程復雜、成本高，催化反應需要輔酶的持續(xù)參與。采用丙烯-甲烷共氧化的方法，由甲烷深度氧化為二氧化碳時產(chǎn)生的輔酶NADH來維持丙烯環(huán)氧化反應的連續(xù)進行，反應表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。利用甲烷氧化菌進行生物催化需要以完整細胞形式進行，而以完整細胞進行催化時，必須有足夠的細胞密度和催化活性，但目前甲烷氧化菌的高密度培養(yǎng)還未實現(xiàn)工業(yè)化，所以需要進一步探討與實踐。Su等［34］通過優(yōu)化溫度、初始丙烯濃度、甲酸鈉和MgCl2的濃度，使用甲烷氧化菌Methylosinus trichosporim OB3b高密度細胞培養(yǎng)生產(chǎn)環(huán)氧丙烷，環(huán)氧丙烷產(chǎn)率提高近4倍。

3.4 生物修復劑

甲烷氧化菌是有用的去除重金屬和轉化有機污染物的生物修復劑，因為MMO（特別是sMMO）具有廣泛的底物范圍。sMMO可以轉化各種烴，包括烷烴、烯烴、脂環(huán)烴、芳香族化合物和鹵代脂肪族化合物［35］。sMMO可降解的氯代化合物包括氯仿、二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯和氯氟烴，甚至氯乙烯。甲烷氧化菌的這一特性使其在環(huán)境治理中具有非常重要的應用價值，例如去除垃圾填埋氣中的非甲烷有機氣體［36］。填埋氣中除了占主要成分的甲烷和二氧化碳外，還有約占填埋氣總體積1%的各種非甲烷有機氣體，如氯乙烯、四氯乙烯、苯、甲苯等，這些氣體對人類以及環(huán)境的危害非常大。

生物廢水反硝化系統(tǒng)需要有機碳來促進硝酸鹽還原為氮氣。然而，現(xiàn)代化的污水處理廠經(jīng)常還需要補充昂貴的外部碳源（如乙醇），以達到更嚴格的排放限制。使用甲烷作為低成本碳源來促進反硝化是非常有益的。20世紀70年代，研究人員提出將甲烷引入反硝化過程，但純甲烷氧化菌的反硝化作用在40年后仍未得到驗證。盡管甲烷氧化菌可以催化氮循環(huán)過程（如硝化作用和固氮作用），但它不能完全進行反硝化［37］。甲烷被甲烷氧化菌利用，甲烷氧化菌又為反硝化細菌提供電子供體（如乙酸鹽）。由于目前正在研究更便宜的廢水脫氮方法，最近有關甲烷氧化與反硝化作用的研究［38］有所增加，各種微生物聚生體能夠在有氧和厭氧條件下使用甲烷作為脫氮的唯一碳源。

4 結語

甲烷氧化菌可以利用甲烷產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括單細胞蛋白質(zhì)、生物聚合物、可溶性代謝物（甲醇、甲醛和有機酸等）、脂質(zhì)（生物柴油和保健品）和維生素B12等。甲烷氧化菌產(chǎn)生的一些酶（脫氫酶、氧化酶和過氧化氫酶）是具有高轉化效率且有價值的產(chǎn)物，可以生成甲醇或甲酸等。活體培養(yǎng)物可用于生物修復、化學轉化（丙烯至環(huán)氧丙烷）、廢水脫氮和組成生物傳感器等。由此可見，甲烷氧化菌的用途廣泛，但真正實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還存在一些困難，如甲烷在水中溶解性差、甲烷氧化菌生長周期長等，因此還需要進一步的研究與探討。

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