石仙桃多糖對肺炎支原體感染模型小鼠肺泡灌洗液中趨化因子表達的影響

杜輝朝 黃梅青 趙世元

[摘要] 目的 探討石仙桃多糖（PCLP）對肺炎支原體肺炎模型小鼠肺泡灌洗液（BALF）中趨化因子的影響。 方法 90只BABL/C裸鼠，采用隨機抽簽法分為模型組、克拉霉素組和PCLP組，每組30只。用類胸膜肺炎生物肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)肺炎支原體，將成功培養(yǎng)的肺炎支原體滴入裸鼠鼻腔1×107 CCU/mL菌液各50 μL，共8 d，在最后一次接種后第2天開始用PCLP干預(yù)。在干預(yù)1、3 d和6 d后，分別收集小鼠BALF，用SP4瓊脂平板定量培養(yǎng)BALF肺炎支原體，肺部組織用中性甲醛固定HE染色，觀察肺炎支原體感染小鼠肺的病變程度，用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定小鼠BALF中趨化因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、γ-干擾素誘導(dǎo)性單核因子趨化因子（MIG）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）以及角質(zhì)細胞誘導(dǎo)因子（KC）等趨化因子的水平。 結(jié)果 與模型組比較，石仙桃多糖組BALF定量培養(yǎng)肺炎支原體菌落數(shù)量有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），PCLP組肺部炎癥明顯好轉(zhuǎn)，肺組織病理評分和肺實質(zhì)炎癥評分下降（P < 0.05），石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體肺炎小鼠3 d后，小鼠BALF中細胞因子MIP-1α、MIG以及IP-10的表達明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 PCLP顯著減輕肺炎支原體小鼠肺部炎癥，其機制可能與降低肺炎支原體模型小鼠體內(nèi)MIP-1α、MIG和IP-10等趨化因子的表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 石仙桃多糖；肺炎支原體；趨化因子

[中圖分類號] R730.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（a）-0008-04

Effects of Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides on the levels of chemokines of bronchoalveolar lavage fluid in a murine model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia

DU Huichao1 HUANG Meiqing2 ZHAO Shiyuan3

1.Department of Pharmacy， Chongzuo People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 2.Department of Paediatrics， Chongzuo People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 3.Affiliated National Medical Center Laboratory of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To investigate the Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides （PCLP） on mice model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） effect of chemokine. Methods Ninety BABL/C nude mice were randomized into model group， clarithromycin group and polysaccharide group， 30 rats in each group. Medium of Mycoplasma pneumoniae with PPLO broth， the successful isolation of Mycoplasma pneumoniae drops into the nasal cavity in 1×107 CCU/mL 50 μL， 8 d， on the second day after inoculation to 1 last polysaccharide with Pholidota intervention. After intervention of 1， 3 d and 6 d， respectively， bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were collected， Mycoplasma pneumoniae of BALF was cutured by SP4 agar plate quantitative recovery of lung tissue， by formalin fixation and HE staining， the lesions of mouse lung of Mycoplasma pneumoniae infection in BALF mice were observed， Macrophage inflammatory protein-1α （MIP-1α）， MIG， KC， Macrophage inflammatory protein-1 （MCP-1） and interferon-γ-inducible protein 10 （IP-10） chemotaxis cytokine levels were measured by ELISA. Results BAL Mycoplasma pneumoniae pneumonia concentrations in mice treated with PCLP tended to be reduced compared with mice treated with placebo （MpPl）， however there was no statistically significant difference （P > 0.05）； the lung HPS was significantly lower， as well as the parenchymal-pneumonia subscore. 3 d after Polysaccharide intervention in Mycoplasma pneumoniae pneumonia mice， the expression of chemokines MIP-1α， MIG and IP-10 in BALF mice were significantly reduced， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Polysaccharide significantly reduce the Mycoplasma pneumoniae lung inflammation in mice， the mechanism may be related to the inhibition of MIP-1α， MIG and IP-10 chemokines in vivo in mice model of Mycoplasma pneumoniae.

[Key words] Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides； Mycoplasma pneumoniae； Chemokines

石仙桃來源于蘭科石仙桃屬植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.的假鱗莖或全草，廣泛分布于福建、廣東、廣西等。其水提物具有養(yǎng)陰、清肺、利濕、消瘀的功效，民間用來治療眩暈、頭痛、咳嗽、吐血、夢遺、痢疾等[1]。石仙桃主要成分是多糖[2]，其藥理作用研究較少。本課題組采用石仙桃提取的石仙桃多糖（Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides，PCLP），通過建立肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）肺炎模型BALB/c小鼠，通過定量培養(yǎng)肺泡灌洗液（broncho？鄄alveolar lavage fluid，BALF）肺炎支原體、肺組織病理學(xué)評分（histopathological score，HPS）和檢測BALF中趨化因子單核細胞趨化蛋白-1（Monnocyte chemoattr？鄄actant protin-1，MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（Mac？鄄rophage inflammatory protein-1ɑ，MIP-1ɑ）、γ-干擾素誘導(dǎo)性單核因子趨化因子（MIG）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-γ-inducible protein 10，IP-10）以及角質(zhì)細胞誘導(dǎo)因子（keratinocyte chemoattractant，KC）等趨化因子的表達，探討石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎小鼠的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用藥

PCLP的提取[2]，石仙桃鱗徑采自廣西柳州柳江區(qū)境內(nèi)，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，石仙桃鱗徑洗凈后切細，干燥后打粉。石仙桃粉加1︰40水80℃回流5 h，待冷卻后用無水乙醇沉淀，沉淀物用丙酮和乙醚萃取數(shù)次，得粗多糖。粗多糖用Sevag法脫除蛋白質(zhì)，用95%乙醇沉淀，再將沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脫水，重復(fù)操作數(shù)次，得石仙桃多糖。經(jīng)高效色譜，有一對稱單峰，并在260～280 nm無吸收峰，說明多糖含量較高。樣品保存在廣西民族醫(yī)院中心實驗室。

1.1.2 主要儀器和試劑

UV紫外可見分光光度計，美國安捷倫公司；IR EQUINOX 55紅外光譜儀，德國Bruker公司；超導(dǎo)核磁共振譜儀英國VG公司；熔點測定儀，北京科儀電光儀器廠。柱層析用硅膠（100～200目），青島海洋化工廠生產(chǎn)，批號：14089；薄層層析硅膠（200～300目），青島海洋化工廠生產(chǎn)，批號：141020。

1.1.3 實驗動物

BALB/c小鼠，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物動物合格證編號：SCXK（京）2016-009。BALB/c小鼠5周齡，（20±2）g，雌雄各半，小鼠在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，BALB/c小鼠飼養(yǎng)條件：室溫20～25℃，用干燥鋸末墊底，室內(nèi)通風(fēng)良好，光線良好充足。

1.1.4 其他試劑

PPLO肉湯培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司，肺炎支原體菌液購于上海寶米科生物科技有限公司?？死顾鼐忈屍?61201，江西制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。MIP-1α（批號：20160905）、MIG（批號：20161005）、KC（批號：20160506）、MCP-1（批號：20160803）以及IP-10（批號：20160801）等趨化因子購于BioSource International，Camarillo，CA.公司。

1.1.4 儀器

酶標儀，上?？迫A生產(chǎn)，型號：MK3。

1.2 實驗方法

1.2.1 肺炎支原體的培養(yǎng)

肺炎支原體在每瓶20 mL的SP4肉湯內(nèi)于37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，肉湯變成橙色，倒出上清液，加新鮮的SP4肉湯2 mL到燒瓶，收集貼壁存活肺炎支原體。將肺炎支原體配成108～109 CFU/mL，加制霉菌素（50 U/mL）和氨芐青霉素（1 mg/mL），樣本保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物模型的建立

實驗方案由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，所有的動物按照實驗動物的護理和使用指南處理。新購BALB/c小鼠適應(yīng)新環(huán)境3 d。90只BALB/c小鼠隨機抽簽為模型組、克拉霉素組和石仙桃多糖組，每組30只。各組小鼠第0天接種含1×107 CCU/mL肺炎支原體菌液各50 μL；第5、8和9天接種含1×107 CCU/mL肺炎支原體菌液各100 μL。石仙桃多糖組小鼠于第9 d起首次皮下注射石仙桃多糖20 mg/kg，以后每天按10 mg/kg連續(xù)6 d皮下注射；克拉霉素組小鼠于第9天起首次皮下注射克拉霉素10 mg/kg，以后每天按5 mg/kg連續(xù)6 d皮下注射；模型組在相同時間注射等體積的生理鹽水。用藥期間每天觀察各組小鼠表現(xiàn)，如小鼠存活、進食、飲水、活動度、精神狀態(tài)差，有無豎毛寒戰(zhàn)、咳嗽、口鼻分泌物有無增多。在用藥1、3 d和6 d后，各組分別取10只小鼠，用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后用25號針頭將500 μL SP4肉湯注入肺部，隨后又將該液抽吸到注射器，BALF分3管，第1管做肺炎支原體培養(yǎng)，第2管做細胞計數(shù)，第3管離心吸上清并儲存在-80℃；肺標本用10%福爾馬林溶液固定進行組織學(xué)評價。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 BAL肺炎支原體培養(yǎng) 將BAL用SP4肉湯10倍稀釋，接種在SP4瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)48 h。通過計數(shù)瓊脂板上菌落數(shù)量推算BAL標本細菌數(shù)量（用log10 CFU/mL表示）。

1.2.3.2 肺組織病理學(xué)評分（HPS）和肺實質(zhì)評分 肺組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色。肺組織HPS由專業(yè)病理醫(yī)師雙盲鏡檢。HPS分級基于細支氣管支氣管浸潤數(shù)目、細支氣管支氣管管腔滲出程度、血管周圍浸潤百分率和實質(zhì)性肺炎嚴重程度（中性粒細胞肺泡浸潤）；該HPS系統(tǒng)分值0～26分，分數(shù)越高代表肺組織炎性浸潤程度越高。實質(zhì)性肺炎的得分是基于分級的中性粒細胞肺泡浸潤（評分：0分，沒有實質(zhì)性肺炎；3分，片狀實質(zhì)性肺炎；5分，片狀融合實質(zhì)性肺炎）。

1.2.3.3 各組小鼠BALF中細胞因子的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定BALF中MIP-1α、MIG、KC、MCP-1以及IP-10等粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的水平，操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般情況

BALB/c小鼠感染肺炎支原體第1天，多數(shù)小鼠出現(xiàn)疲倦、豎毛，造模第3天，小鼠出現(xiàn)咳嗽、食欲不振、體重減輕，有少數(shù)小鼠轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，小鼠肺組織出現(xiàn)充血，BALF呈紅色渾濁。說明造模成功。

2.2 各組小鼠BALF肺炎支原體培養(yǎng)

石仙桃多糖組治療肺炎支原體小鼠3、6、9 d后，各組小鼠BALF定量培養(yǎng)肺炎支原體，結(jié)果顯示，與模型組比較，用克拉霉素治療肺炎支原體小鼠1、3、6 d后，小鼠BALF肺炎支原體有減少的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.3 各組肺組織HE染色和肺組織病理評分

石仙桃多糖組治療肺炎支原體肺炎小鼠3 d后，小鼠肺組織HPS評分和實質(zhì)性肺炎評分明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.035、0.004）；尤其是治療3 d后小鼠肺組織HPS評分和實質(zhì)性肺炎評分降低非常明顯（P = 0.002、0.025），見圖2～3。HE染色可見，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)重度炎癥改變：肺泡出現(xiàn)大量的滲出物，肺泡間質(zhì)增寬，在支氣管和血管周圍和肺泡間質(zhì)有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤；克拉霉素組治療肺炎支原體模型組6 d后炎癥細胞明顯減少；石仙桃多糖治療組小鼠6 d后肺組織出現(xiàn)中度也明顯減少：可見肺泡間質(zhì)稍增寬，在支氣管、血管周圍有少量淋巴細胞和巨噬細胞，見圖4。

2.4 石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體肺炎小鼠1、3、6 d對BALF中各趨化因子表達的影響

石仙桃多糖組干預(yù)肺炎支原體肺炎小鼠1 d，小鼠BALF中KC和MCP-1的表達有所下調(diào)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；小鼠BALF中MIG、IP-10等趨化因子的表達迅速下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表1。用石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體肺炎小鼠3 d后，小鼠BALF中MIP-1α、MIG、KC、MCP-1以及IP-10等趨化因子的表達下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表2。石仙桃多糖組干預(yù)肺炎支原體肺炎小鼠6 d后，小鼠BALF中MIG表達下調(diào)非常明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；小鼠BALF中MIP-1α、KC和MCP-1等趨化因子表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表3。

3 討論

肺炎支原體是一種“非典型”細菌，缺乏細胞壁，在兒童和成人急性下呼吸道感染中起著重要的作用，在一般人群有20%～30%因肺炎支原體致社區(qū)獲得性肺炎[5]。在過去的幾十年里，肺炎支原體感染引起反應(yīng)性氣道疾病和哮喘得到越來越多的關(guān)注[6-9]。臨床研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類藥物或四環(huán)素治療肺炎支原體肺炎，減少肺炎的發(fā)病率，縮短病程，降低哮喘復(fù)發(fā)率，是治療肺炎支原體肺炎的首選[10]。然而，盡管用大環(huán)內(nèi)酯類、酮內(nèi)酯類以及肽脫甲?；敢种苿┧幬镏委焺游锓窝字гw肺炎能顯著改善調(diào)查肺部炎癥，但肺炎支原體在體內(nèi)無法根除，加上治療時間長，治療中易產(chǎn)生嘔吐、腹瀉、納差等消化道癥狀。

石仙桃屬（Pholidota）是蘭科（orehidaeeae）植物，別名石橄欖、石上仙桃和石上蓮等。石仙桃性甘、淡、涼，具有清熱潤燥、化疾止咳、滋陰解毒、涼血止痛等功效，民間用于肺熱咳嗽、肺結(jié)核咳血、淋巴結(jié)結(jié)核、小兒舟積、胃十二指腸潰瘍、外用治療慢性骨髓炎等。用石仙桃的鮮品或干品煎湯內(nèi)服，可治肺結(jié)核咯血、慢性咳嗽、胃腸炎、慢性胃炎、小便不利、濕熱浮腫、咽喉腫痛[11-12]。石仙桃的主要成分是多糖，含量高達2.25%[13]。研究表明，多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、降糖等作用[14]。但迄今為止，有關(guān)石仙桃多糖抗肺炎支原體肺炎未見報道。

本次實驗，定量肺炎支原體滴鼻BALB/c小鼠，小鼠感染肺炎支原體1～3 d，大多數(shù)小鼠進食減少，出現(xiàn)明顯疲勞，部分有豎毛現(xiàn)象；造模第3天，大部分小鼠出現(xiàn)咳嗽，體重下降；造模第6天，個別小鼠出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈，解剖小鼠肺部，發(fā)現(xiàn)肺組織出血，病理評分較高，肺組織有較為嚴重的炎性反應(yīng)，說明造模成功。用石仙桃多糖干預(yù)小鼠3 d后，小鼠活動增加，咳嗽減少，毛發(fā)變光亮，體重增加；石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體小鼠后，其BALF肺炎支原體培養(yǎng)菌落明顯比模型組減少，肺組織病理評分較低，肺組織炎性反應(yīng)減少。

本實驗中采用石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體模型BALB/c小鼠1、3、6 d，定量培養(yǎng)小鼠BALF肺炎支原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用藥干預(yù)后的肺炎支原體有減少的趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎定量微生物培養(yǎng)結(jié)果與其改善肺部炎癥不相關(guān)，其機制未明。

肺炎支原體感染機體后通過直接或間接損傷導(dǎo)致胸膜炎，引起滲出增加、免疫炎性反應(yīng)增強以及受損細胞釋放各種酶、補體、生物活性物質(zhì)增加、導(dǎo)致胸膜毛細血管通透性增高。

研究發(fā)現(xiàn)機體感染后趨化因子或趨化因子受體的上調(diào)或下調(diào)可以影響疾病的易感性和嚴重性。趨化因子根據(jù)氨基端半胱氨酸的排列方式不同，分為C、CC、CXC和CX3C亞家族，它們通過與7次跨膜的、G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體相結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)[15-17]，IP-10和MIG介導(dǎo)白細胞向移植物募集，IP-10是表達于Th1細胞的趨化因子受體的功能激動劑，在淋巴細胞的免疫活化、炎癥浸潤、細胞遷移和發(fā)生效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[18]。趨化因子MIG是CXC趨化家族的成員，主要趨化白細胞，參與機體炎性反應(yīng)，同時MIG亦能影響巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和肥大細胞活性，在調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)中起重要作用，具有廣泛的生物學(xué)活性，可能參與腫瘤血管形成、促進細胞有絲分裂和調(diào)節(jié)宿主免疫功能等作用[19]。MCP-1、MIP-1α均屬于趨化因子亞組，通過與蛋白偶聯(lián)的跨膜受體傳導(dǎo)信號，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮趨化、吞噬以及調(diào)節(jié)炎癥因子合成的生物學(xué)功能，能引起各種急慢性炎癥，在許多炎癥性疾病的發(fā)病中起重要作用[20]。本實驗中我們用石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體模型BALB/c小鼠1 d，MIG、IP-10等趨化因子表達首先下調(diào)，干預(yù)肺炎支原體模型BALB/c小鼠3 d，小鼠BALF中MIP-1α、MIG、MCP-1以及IP-10等趨化因子表達下降明顯，干預(yù)6 d，小鼠BALF中MIG表達下調(diào)。石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體模型BALB/c小鼠1～6 d，小鼠BALF中MIG的表達一直保持下調(diào)?？赡艿脑蚴鞘商叶嗵勤吇准毎?、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和肥大細胞活性，減輕肺炎支原體小鼠肺部炎癥。

綜上所述，石仙桃多糖顯著減輕肺炎支原體小鼠肺部炎癥，改善肺炎支原體模型小鼠呼吸道癥狀。其機制可能是與石仙桃多糖降低肺炎支原體模型小鼠體內(nèi)MIP-1α、MIG、MCP-1以及IP-10的趨化因子的表達有關(guān)。本研究為開發(fā)石仙桃多糖作為抗肺炎支原體肺炎新藥和臨床應(yīng)用奠定一定的試驗基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-24 本文編輯：任 念）