溫度脅迫對(duì)巖扇貝幼貝抗氧化酶活力的影響

曹善茂，王瀟，劉鋼，李曉雨，劉陽(yáng)

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

巖扇貝Crassadoma gigantea隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae，自然分布在北美太平洋沿岸，成年巖扇貝閉殼肌的大小、風(fēng)味與其他幾種養(yǎng)殖扇貝相比有很大優(yōu)勢(shì)。目前，巖扇貝已經(jīng)被大連海洋大學(xué)引入中國(guó)并成功完成了室內(nèi)全人工育苗及海上試養(yǎng)殖工作[1]，并對(duì)其代謝[2－3]、營(yíng)養(yǎng)成分[4]等進(jìn)行了研究。巖扇貝作為新引進(jìn)品種，幼貝能否在養(yǎng)殖地區(qū)的海域順利生長(zhǎng)發(fā)育是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[5]。貝類致病、致死等情況涉及貝類抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)[6]，尤其在幼貝階段。扇貝稚貝和幼貝期生長(zhǎng)速度和成貝相比較快[7]，稚貝和幼貝生長(zhǎng)發(fā)育受環(huán)境因子的影響相比成貝也更明顯[8－9]，因此，研究環(huán)境因子對(duì)巖扇貝幼貝抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，對(duì)巖扇貝的養(yǎng)殖具有一定的參考意義。

貝類的抗氧化系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單，易受外界脅迫影響，其中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)和總抗氧化能力 (T－AOC)在很多對(duì)貝類環(huán)境脅迫的研究中被認(rèn)為可以作為檢測(cè)指標(biāo)[10]。影響這些酶活力的環(huán)境因子有溫度[11－12]、pH[13－14]、鹽度、規(guī)格和餌料等，在這些因子中溫度是影響抗氧化酶活力的重要因素。之前關(guān)于溫度對(duì)抗氧化酶活力的影響研究大多數(shù)集中在離體粗酶液提取后反應(yīng)溫度對(duì)抗氧化酶活性的影響上[15]，這些研究結(jié)果對(duì)確定不同物種生物抗氧化酶活力的測(cè)定方法有參考價(jià)值，但與外界環(huán)境溫度變化對(duì)貝類體內(nèi)抗氧化酶活力的實(shí)際影響不同。關(guān)于溫度脅迫對(duì)貝類抗氧化酶活力影響的報(bào)道，也集中在以適宜貝類生長(zhǎng)發(fā)育的水溫 (通常為15～20℃)為對(duì)照，通過升溫或者降溫來完成溫度脅迫[16]，這些研究對(duì)象都是成貝，而以低溫為起點(diǎn)逐漸升溫的溫度脅迫對(duì)幼貝抗氧化酶活力影響的研究很少。巖扇貝最適宜的生長(zhǎng)溫度為15℃，在15℃條件下巖扇貝生長(zhǎng)發(fā)育速度最快[1]。為此，本研究中在實(shí)驗(yàn)室模擬扇貝生長(zhǎng)海域的溫度，從最低溫開始逐步升溫，檢測(cè)了巖扇貝幼貝鰓組織中3種抗氧化酶活力在一定時(shí)期隨溫度的變化情況，旨在為巖扇貝幼貝養(yǎng)殖技術(shù)的完善和推廣、養(yǎng)殖生產(chǎn)中分苗時(shí)機(jī)的把握，以及對(duì)幼貝的養(yǎng)殖管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用巖扇貝親貝于2015年11月自加拿大溫哥華引進(jìn)，親貝于2016年2月經(jīng)人工育苗得到稚貝，稚貝經(jīng)海上中間育成，于2016年5月將所得子一代幼貝移至大連市龍王塘海域養(yǎng)殖至12月齡，取殼長(zhǎng)為(36.39±4.45)mm、殼高為(37.62±6.37)mm的幼貝400枚，于大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)用海水經(jīng)過沙濾罐過濾，用循環(huán)水控溫裝置進(jìn)行控溫，餌料來自圓柱形高密度餌料培養(yǎng)裝置。

1.2 方法

1.2.1 暫養(yǎng)與管理 將試驗(yàn)用400枚巖扇貝幼貝暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室海水循環(huán)水控溫裝置中，水溫為(4.1±0.2)℃，鹽度為 (31.3±0.2)，pH 為(8.14±0.15)。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，循環(huán)水，每天全量更換海水1次，每天4:00、10:00、16:00、22:00投喂新月菱形藻、湛江等邊金藻混合餌料，第二天虹吸出幼貝殘餌、糞便等雜質(zhì)，及時(shí)清理死貝，暫養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。

1.2.2 溫度處理及取樣 根據(jù)對(duì)大連市龍王塘海區(qū)2015年全年海水溫度追蹤測(cè)量 (全年水溫變化在3.8～23.8℃)， 設(shè)定 5、 10、 15(對(duì)照)、 20、25℃ 5個(gè)溫度試驗(yàn)組，實(shí)測(cè)平均溫度分別為(5.2±0.2)、 (9.7±0.2)、 (15.2±0.2)、 (20.4±0.2)、 (25.3±0.2)℃，每個(gè)溫度組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行試驗(yàn)組放25枚幼貝。水溫從 (4.1±0.2)℃開始，以每天1℃的幅度進(jìn)行升溫，到達(dá)設(shè)定溫度時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別在計(jì)時(shí)后1、6、12、24、48 h時(shí)隨機(jī)挑選幼貝進(jìn)行抗氧化酶活力測(cè)定試驗(yàn)，每個(gè)溫度組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3組平行試驗(yàn)。1.2.3 內(nèi)臟、鰓組織上清液的制備 從每個(gè)平行組隨機(jī)取3枚幼貝，然后在冰盤上取幼貝的內(nèi)臟組織和鰓組織，分別稱其質(zhì)量，按質(zhì)量體積比為1 mg∶4 mL加入預(yù)冷的生理鹽水，用電動(dòng)勻漿機(jī)(10 000 r/min)在冰浴條件下勻漿3 min，勻漿液經(jīng)離心機(jī)以3500 r/min離心10 min，取上清液備用。由于內(nèi)臟組織每個(gè)溫度時(shí)間點(diǎn)上的酶活力測(cè)定值誤差偏差較大，故本試驗(yàn)中僅選用巖扇貝鰓組織上清液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.4 抗氧化酶活力的測(cè)定 對(duì)鰓組織上清液分別進(jìn)行SOD、CAT活力和T－AOC能力的測(cè)定。酶活力的測(cè)定使用南京建成科技有限公司試劑盒。根據(jù)計(jì)算要求，每次測(cè)量設(shè)置空白對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管、測(cè)定管，每管設(shè)置3個(gè)平行，計(jì)算方法和原理均參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Duncan進(jìn)行多重分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力的變化

從圖1可見:溫度在5℃時(shí)，SOD活力相對(duì)于其他溫度組均較低，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD活力均顯著低于其他溫度組 (P＜0.05)；隨著溫度逐漸升高，10、15、20、25℃組SOD活力保持較高值，比較穩(wěn)定；在溫度脅迫1 h時(shí)，10℃組與15℃組無顯著性差異 (P＞0.05)，20℃與25℃組無顯著性差異 (P＞0.05)，其他溫度組間均有顯著性差異(P＜0.05)；脅迫時(shí)間超出6 h時(shí)，上述4個(gè)溫度組間均無顯著差異 (P＞0.05)。

在受脅迫的48 h內(nèi)，5℃組SOD活力略有下降；10、15℃組SOD活力隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定；20℃組SOD活力在溫度脅迫12 h時(shí)最高；25℃組SOD活力在溫度脅迫24 h時(shí)最高。

圖1 溫度漸變對(duì)巖扇貝幼貝SOD酶活力的影響Fig.1 Impact of gradual change in temperaturet on SOD activity in rock scallop Crassadoma gigantea

2.2 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中CAT活力的變化

從圖2可見:在溫度逐漸升溫的過程中，5、10、15、20℃組CAT活力比較穩(wěn)定且組間無顯著性差異 (P＞0.05)，這4個(gè)組的CAT活力均小于25℃組；溫度脅迫1 h時(shí)，僅20℃和25℃組的CAT活力有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫6 h時(shí)，5個(gè)溫度組均無顯性著差異 (P＞0.05)；溫度脅迫12 h時(shí)，5、20℃組均與25℃組有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫24 h時(shí)，僅5℃與25℃組的CAT活力有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫48 h時(shí)，5、10、15℃均與25℃組有顯著性差異 (P＜0.05)。

在溫度脅迫的48 h內(nèi)，5℃組的CAT活力略有下降后基本不變；10、15、20℃組的CAT活力基本穩(wěn)定；25℃組CAT活力緩慢上升。

圖2 溫度漸變對(duì)巖扇貝幼貝CAT酶活力的影響Fig.2 Impact of gradual change in temperaturet on CAT activity in rock scallop Crassadoma gigantea

2.3 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中T－AOC能力的變化

從圖3可見:在溫度逐漸升溫的過程中，15℃組幼貝鰓組織中T－AOC能力均顯著高于其他溫度組 (P＜0.05)；溫度脅迫1～6 h時(shí)，15℃組TAOC能力顯著高于其他4組 (P＜0.05)，5℃組顯著低于其他4組 (P＜0.05)；脅迫12～48 h時(shí)，15℃組T－AOC能力顯著高于25℃組 (P＜0.05)，二者均顯著高于10、20℃組 (P＜0.05)，而5℃組顯著低于其他4組 (P＜0.05)?？梢?，溫度從15℃升高或降低，T－AOC能力都會(huì)顯著下降 (P＜0.05)，溫度從15℃降低至5℃時(shí)，T－AOC能力的下降幅度顯著高于溫度從15℃升高至25℃時(shí)T－AOC能力的下降幅度 (P＜0.05)。

在受脅迫的48 h內(nèi)，5、10、20℃組T－AOC能力較穩(wěn)定，15、25℃組的T－AOC能力略有升高。

圖3 溫度漸變對(duì)巖扇貝幼貝T－AOC能力的影響Fig.3 Impact of gradual change in temperaturet on TAOC capacity in rcok scallop Crassadoma gigantea

3 討論

3.1 水溫脅迫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織抗氧化酶活力的影響

溫度是水生生物尤其是貝類生存環(huán)境的關(guān)鍵因素之一，海洋生物的生長(zhǎng)、繁殖和抗氧化能力等都與海水溫度密切相關(guān)，尤其在夏季持續(xù)高溫和春季水溫從低溫回升時(shí)，貝類死亡率明顯增加，很容易造成大面積死亡的現(xiàn)象。溫度過高或者過低都會(huì)在貝類體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，這些自由基在體內(nèi)積累會(huì)對(duì)貝類造成一定損傷甚至死亡。在貝類的抗氧化體系中，主要依靠SOD、CAT來清除過多的自由基，尤其是SOD，其活力和生物體免疫水平息息相關(guān)[17]。SOD是一種還原酶，存在多種異構(gòu)體，能夠直接作用于超氧陰離子(O2－·)，并與其發(fā)生歧化反應(yīng)，生產(chǎn)危害較低的過氧化氫和分子氧，減輕自由基對(duì)機(jī)體的損害。CAT與SOD具有協(xié)同作用，可將SOD催化生成的過氧化氫催化生成氧氣和水，以消除超氧陰離子等中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害。T－AOC是體現(xiàn)抗氧化體系的抗氧化能力總和，包含了直接作用在自由基或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止自由基在機(jī)體內(nèi)發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)。

本研究中設(shè)計(jì)了5組不同溫度試驗(yàn)組，從低溫逐步升溫完成溫度脅迫試驗(yàn)，涵蓋了大連市龍王塘海域2015年全年海水溫度跨度范圍 (全年水溫變化在3.8～23.8℃)，探究了水溫脅迫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織中抗氧化酶活力的變化。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，當(dāng)溫度為15～25℃時(shí)，巖扇貝鰓幼貝組織中SOD活力無顯著性差異，CAT活力緩慢上升，在25℃時(shí)CAT活力達(dá)到最高，T－AOC水平在溫度超過15℃時(shí)顯著下降，這與賁月等[18]發(fā)現(xiàn)溫度從15℃漸變升溫到26℃過程中，隨著溫度升高蝦夷扇貝體腔液中CAT活力顯著升高、SOD活力差異不顯著、T－AOC能力先顯著下降后逐漸回復(fù)的結(jié)果基本一致。本研究中還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，當(dāng)溫度從15℃降至5℃時(shí)，溫度變化對(duì)CAT活力影響不明顯，這與時(shí)少坤[19]對(duì)雜交鮑抗氧化酶研究結(jié)果中溫度由18℃降至6℃時(shí)CAT活力與對(duì)照組18℃無顯著性差異的結(jié)果也是一致的。本研究中，5℃時(shí)SOD活力顯著低于10、15、20、25℃組，可見低溫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力有著明顯的抑制作用；T－AOC水平在溫度從15℃降至5℃時(shí)顯著下降，下降幅度大于從15℃升到25℃時(shí)T－AOC的下降水平，這表明低溫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織中T－AOC活力有著明顯的抑制作用。

3.2 水溫脅迫試驗(yàn)中影響巖扇貝幼貝鰓組織抗氧化酶活力的其他因素

溫度變化的過程中往往會(huì)引起抗氧化酶表達(dá)和活力增加[20－22]，但是抗氧化酶的變化涉及到很多復(fù)雜的因素交互影響。一是，試驗(yàn)物種的不同會(huì)導(dǎo)致溫度對(duì)生物體的抗氧化酶活力影響的不同，王文文[23]、孔祥會(huì)等[24]研究表明，菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、鋸緣青蟹Scylla serrata在低溫下可以保持高水平的抗氧化酶活力，低溫下菲律賓蛤仔、鋸緣青蟹體內(nèi)SOD、CAT活性水平已經(jīng)高出其生長(zhǎng)發(fā)育最適溫度下的活性，這與溫度對(duì)扇貝抗氧化酶活力影響的研究結(jié)果不符[18]；二是，試驗(yàn)對(duì)象發(fā)育時(shí)期不同，如本試驗(yàn)中使用小規(guī)格幼貝，小規(guī)格貝類單位組織干重耗氧率和排氨率較大，代謝作用與成貝相比較強(qiáng)[25]，受溫度的波動(dòng)及低溫和高溫等惡劣環(huán)境的影響較大，高振錕等[26]研究證明了小規(guī)格蝦夷扇貝在受一定溫度波動(dòng)后死亡率高于大規(guī)格扇貝，成貝能夠適應(yīng)一定范圍的水溫變化，尤其是對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力尤為明顯，成貝和幼貝的抗氧化酶活力對(duì)低溫的響應(yīng)也不一樣[16，26]；三是，試驗(yàn)設(shè)定溫度范圍、降溫方式和脅迫時(shí)間不同，很多研究是以適溫 (15℃左右)作為對(duì)照，分別升溫、降溫來完成的，而在低溫脅迫條件下，很多研究得出的結(jié)果與在常溫下的結(jié)果不一致甚至相反[27]，類似結(jié)果不一致的還有一些急性惡劣條件對(duì)貝類抗氧化酶活力的研究[26－29]，生物體若受到輕度逆境脅迫，其體內(nèi)的SOD活力往往會(huì)升高[30－31]，若受到重度或長(zhǎng)時(shí)間逆境脅迫，SOD活力通常降低，這就促使生物體內(nèi)積累活性氧，從而對(duì)生物體造成損害[32－33]。本研究中的低溫和高溫就是一種逆境，在低溫條件下SOD活力、T－AOC能力均低于15℃時(shí)的活力。綜合溫度對(duì)3種抗氧化酶活力的影響，結(jié)果表明，15℃條件下巖扇貝幼貝抗氧化酶活力較高，從抗氧化酶活力變化證明15℃是巖扇貝生長(zhǎng)的最適宜溫度。

綜上所述，在每天升溫1℃的條件下，高溫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力影響不明顯，對(duì)CAT活力有著明顯的誘導(dǎo)作用，對(duì)T－AOC能力有著明顯的抑制作用；低溫對(duì)巖扇貝幼貝鰓組織中CAT活力影響不明顯，對(duì)SOD、T－AOC能力有著明顯的抑制作用，其中低溫對(duì)T－AOC能力抑制程度比高溫大。綜合溫度對(duì)3種抗氧化酶活力的影響表明了15℃為巖扇貝幼貝抗氧化酶活力最高的溫度?？傊?，15℃巖扇貝幼貝抗氧化酶活力最高，溫度過低或過高對(duì)巖扇貝幼貝的抗氧化酶活力均產(chǎn)生顯著影響，這表明抗氧化酶活力可以作為巖扇貝對(duì)溫度脅迫檢測(cè)的指標(biāo)，本研究結(jié)果可為巖扇貝幼貝養(yǎng)殖技術(shù)的完善和推廣、養(yǎng)殖生產(chǎn)中分苗時(shí)間的把握及幼貝的養(yǎng)殖管理提供參考。

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