低聚異麥芽糖調(diào)節(jié)腸道菌群及潤腸通便作用的研究

劉重慧,張 靜,范譽川,高兆蘭,魏 濤

(北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191)

低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharide,IMO)又稱為異麥芽低聚糖、異麥芽寡糖、分枝低聚糖等,是淀粉糖的一種,主要成分為葡萄糖分子間以α-1,6糖苷鍵結(jié)合的異麥芽糖(Isomaltose)、潘糖(Panose)、異麥芽三糖(Isomaltotriose)等[1]。

低聚異麥芽糖具有良好的生理功能,能促進腸道有益菌的增殖和所占比例,抑制腸道有害菌及腐敗物質(zhì)形成,低聚異麥芽糖可促進益生菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸[2-3]和短鏈有機酸,可降低腸道pH,促進腸蠕動,改善便秘[4-5],增加維生素含量;促生的有益菌雙歧桿菌能夠產(chǎn)生B族維生素和煙酸、葉酸等人體必需的維生素,而腸道中短鏈脂肪酸的大量積累促進了礦物質(zhì)如鈣、鐵、鎂等礦質(zhì)元素的吸收,提高機體免疫力[6]。低聚異麥芽糖還可調(diào)節(jié)人體脂類代謝,對總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白的降低作用明顯[7]。低聚異麥芽糖還可預(yù)防直腸癌等癌癥的發(fā)生[8]等諸多功能。低聚異麥芽糖抗齲齒性甚佳,可以有效地保護牙齒。低聚異麥芽糖中潘糖對阻礙齒垢形成的效果也極為明顯[9]。低聚異麥芽糖是公認的有發(fā)展前景的益生元,在食品、動物飼料等方面已得到了極大的關(guān)注。但目前研究報道中涉及低聚異麥芽糖最佳含量的內(nèi)容較少。

本文旨在研究不同含量低聚異麥芽糖在體外對益生菌的生長影響,對小鼠體內(nèi)腸道菌群的影響以及低聚異麥芽糖對便秘小鼠潤腸通便的作用,同時研究了低聚異麥糖不同含量對益生菌的影響。以期為功能性食品開發(fā),動物飼料添加劑的開發(fā),醫(yī)藥領(lǐng)域及低聚異麥芽糖分子水平作用機制的研究提供參考,同時為低聚異麥芽糖作用的最佳含量提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低聚異麥芽糖 山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司;復方地芬諾酯 常州康普藥業(yè)有限公司;實驗動物 選用二月齡的BALB/C 二級雌性小鼠,中國醫(yī)學科學院動物中心繁殖場,體重在22～28 g之間共110只;長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) 北京聯(lián)合大學食品科學系微生物實驗室,長雙歧桿菌培養(yǎng)以BBL培養(yǎng)基進行培養(yǎng),嗜酸乳桿菌以MRS培養(yǎng)基進行培養(yǎng);EMB培養(yǎng)基;疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基;LBS瓊脂培養(yǎng)基。

BBL培養(yǎng)基:蛋白胨15.0 g/L,酵母粉2.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,可溶性淀粉0.5 g/L,氯化鈉5.0 g/L,5%半胱氨酸10.0 mL/L,西紅柿浸出液400.0 mL/L,吐溫801.0 mL/L,肝提取液80.0 mL/L,瓊脂 20.0 g/L,pH7.0,121 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母浸出液5.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,乙酸鈉5.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L,吐溫80 1.0 mL/L,硫酸錳0.25 g/L,瓊脂20 g/L,pH6.2～6.4,121 ℃滅菌15 min。

EMB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,乳糖10.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,2%伊紅Y溶液20 mL/L,0.65%美藍溶液10 mL/L,瓊脂17 g/L,pH7.1(將蛋白胨,磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中,調(diào)整pH,分裝,121 ℃滅菌15 min。臨用時加入乳糖并加熱溶化瓊脂,冷卻至50～55 ℃,加入伊紅和美藍溶液,搖勻倒平板)。

疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基:多價胨10.0 g/L,酵母浸膏5.0 g/L,氯化鈉5.0 g/L,K2HPO44.0 g/L,KH2PO41.5 g/L,疊氮化鈉0.5 g/L,七葉苷1.0 g/L,0.05%結(jié)晶紫水溶液0.4 mL,檸檬酸鐵銨0.5 g,瓊脂20 g/L,pH8.0,121 ℃滅菌15 min。

LBS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母粉2.0 g/L葡萄糖20.0 g/L,吐溫801.0 mL/L,K2HPO42.0 g/L,乙酸鈉5.0 g/L,枸櫞酸三氨2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,硫酸錳0.05 g/L,瓊脂2,5 g/L,pH6.0～6.5,121 ℃滅菌15 min。

JA2103N天平 北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司;ZSD-1160多功能生化培養(yǎng)箱 TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD;BX41顯微鏡 OLYMPUS;825-A型厭氧罐 沈陽市第五人民醫(yī)院;灌胃針 上海邦耀生物科技有限公司;微量加樣器 Eppendorf公司;GI54DWS高壓滅菌鍋 zealway公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低聚異麥芽糖培養(yǎng)基設(shè)置 以上述BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),除葡萄糖成分外,其余成分含量均與BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基相同,葡萄糖以表1內(nèi)的糖替代。

表1 低聚異麥芽糖在糖含量中所占的比例Table 1 The percentage of maltose in sugar content

1.2.2 活菌數(shù)的測定 取含有上述不同濃度低聚異麥芽糖的BBL、MRS液體培養(yǎng)基10 mL于20 mL試管中,將純化后的母種以5%的接種量分別接種,37 ℃培養(yǎng),長雙歧桿菌置于厭氧罐中,培養(yǎng)16～24 h。嗜酸乳桿菌采用稀釋平板法計數(shù),長雙歧桿菌采用液封法計數(shù)[10]。

1.2.3 體內(nèi)實驗設(shè)置 所選用的小鼠均按體重隨機分組,腸道菌群實驗設(shè)正常對照組、低劑量組、高劑量組,每組10只,潤腸通便和小鼠小腸推進率實驗分別設(shè)陰性對照組、模型對照組、低劑量組、高劑量組,每組10只。

受試樣品及飼喂劑量:低聚異麥芽糖的飼喂劑量采用0.5、1.0 g/(kg·bw)(人體推薦量5～10倍)作為低、高劑量[11]。采取灌胃法,每日灌胃一次,每次灌胃0.2 mL/(10 g·bw)。灌胃14 d,空白對照組和模型對照組灌胃等量蒸餾水[10]。

腸道微生物的采集與處理:實驗中,給予受試物之前以及最后一次給予受試物后24 h,無菌條件下采取小鼠糞便,將其放入已滅菌的裝有3 mL稀釋液的試管中,稱重,振蕩混勻,待糞便完全均質(zhì)于稀釋液后,采取10倍系列稀釋。選擇合適的稀釋度分別接種在BBL培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基及LBS瓊脂培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)24或48 h后,通過觀察菌落形態(tài),革蘭氏染色鏡檢并計數(shù)菌落[12],計算每克糞便中的雙歧桿菌、大腸桿菌、腸桿菌及乳桿菌的數(shù)量,取對數(shù)后進行統(tǒng)計處理。

小腸推進實驗:在連續(xù)給予受試物21 d后,各組小鼠禁食24 h。實驗開始前各劑量組給予對應(yīng)受試物,正常對照組及模型對照組給予等量蒸餾水。30 min后,除正常對照組外,其余各組灌喂復方地芬諾酯50 mg/(kg·bw)。20 min后,各組灌喂15%碳黑墨水0.5 mL/只。經(jīng)過20 min后,頸椎脫臼處死動物,立即取出自幽門至盲腸部的整段小腸,不加牽引平鋪成直線。測量小腸全長和幽門至墨水運動前沿位移,計算小腸推進率[10]。

小腸推進率(%)=墨水移動距離(cm)/小腸全長(cm)×100

小鼠排便實驗:在連續(xù)給予受試物21 d 后,各組小鼠禁食24 h。除正常對照組外,其余各組灌胃復方地芬諾酯10 mg/(kg·bw)。將小鼠放入鼠籠單獨飼養(yǎng),正常飲水進食。1 h后給各組小鼠灌胃15%碳黑墨水0.5 mL/只(實驗組碳黑墨水含相應(yīng)劑量的受試物)。觀察記錄每只小鼠自灌胃復方地芬諾酯起的首黑便時間以及6 h內(nèi)排便重量[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度梯度低聚異麥芽糖在體外對腸道菌群增殖的影響

2.1.1 對長雙歧桿菌的影響 由表2可以看出,體外實驗中采用不同濃度低聚異麥芽糖與葡萄糖培育長雙歧桿菌,單位體積內(nèi)活菌數(shù)量發(fā)生變化。以50%、75%和100%低聚異麥芽糖替代葡萄糖培養(yǎng),與100%葡萄糖培養(yǎng)相比,單位體積內(nèi)長雙歧桿菌Log CFU/mL顯著增加(p<0.05),分別增加5%、6%和8%。結(jié)果提示,50%、75%、100%低聚異麥芽糖在體外實驗中對長雙歧桿菌的增殖作用顯著。而25%低聚異麥芽糖替代葡萄糖,與100%葡萄糖培養(yǎng)相比對長雙歧桿菌的生長沒有顯著影響,出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于低聚異麥芽糖的含量過低導致對長雙歧桿菌的作用影響不大,由數(shù)據(jù)結(jié)果可推測低聚異麥芽糖對長雙歧桿菌的增殖作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

表2 不同濃度低聚異麥芽糖在體外對長雙歧桿菌的增殖作用Table 2 The effect of different concentrations of isomaltooligosaccharideon the proliferation of Bifidobacterium longum in log CFU/mL)

2.1.2 低聚異麥芽糖對嗜酸乳桿菌的影響 由表3可以看出,體外實驗中采用不同濃度低聚異麥芽糖與葡萄糖培養(yǎng)嗜酸乳桿菌,單位體積內(nèi)活菌數(shù)量發(fā)生變化,以50%,75%和100%低聚異麥芽糖替代葡萄糖培養(yǎng),與100%葡萄糖培養(yǎng)相比,單位體積內(nèi)嗜酸乳桿菌Log CFU/mL分別增加5%(p<0.05),5.6%(p<0.05)和12.5%(p<0.01)。結(jié)果提示,50%,75%,100%低聚異麥芽糖在體外實驗中對嗜酸乳桿菌的增殖作用顯著。而25%低聚異麥芽糖替代葡萄糖,與100%葡萄糖培養(yǎng)相比對嗜酸乳桿菌的生長沒有顯著影響,出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于低聚異麥芽糖的含量過低導致對嗜酸乳桿菌的作用影響不大,由數(shù)據(jù)結(jié)果可推測低聚異麥芽糖對嗜酸乳桿菌的增殖作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

表3 不同濃度低聚異麥芽糖在體外對嗜酸乳桿菌的增殖作用Table 3 The effect of different concentrations of aisomaltooligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus acidophilus in CFU/mL)

2.2 低聚異麥芽糖對小鼠體重的影響

由表4可見,灌胃低、高劑量的低聚異麥芽糖后,與空白對照組相比,小鼠的體重變化沒有統(tǒng)計學意義,說明低聚異麥芽糖對生物體體重的增長沒有明顯的作用效果,這與王少光[13]等的研究結(jié)果是一致的。

表4 低聚異麥芽糖對小鼠體重的影響Table 4 Effect of isomaltooligosaccharide on body weight in

2.3 低聚異麥芽糖對小鼠腸道菌群的影響

由表5可知,在灌胃前腸道菌群無差異的小鼠,連續(xù)給與低劑量組(0.5 mg/(kg·bw))、高劑量組(1.0 g/(kg·bw))低聚異麥芽糖14 d后,與對照組相比,高劑量組腸桿菌及腸球菌數(shù)量并無顯著變化,低劑量組腸球菌也沒有顯著變化,低劑量組腸桿菌則顯著降低。低,高劑量組乳桿菌及雙歧桿菌數(shù)量均有顯著提高,其中低劑量組腸桿菌減少6%(p<0.05),乳桿菌增長5%(p<0.01),雙歧桿菌增長9%(p<0.01);高劑量組的乳桿菌增長9%(p<0.01),雙歧桿菌增長11%(p<0.01)。灌胃前后自身的比較中,空白對照組腸球菌顯著增加14%(p<0.05),乳桿菌增長10%(p<0.01);低劑量組腸桿菌減少14%(p<0.05),乳桿菌增長12%(p<0.05),雙歧桿菌增長15%(p<0.01);高劑量組乳桿菌增長21%(p<0.01),雙歧桿菌增長19%(p<0.01)。說明低聚異麥芽糖可促進乳桿菌,雙歧桿菌等腸道有益菌的增長,同時抑制腸球菌等有害菌的增長,對腸道菌群具有較強的良性調(diào)節(jié)作用,但低、高兩個劑量組對腸道菌群的影響差別不大。

表5 低聚異麥芽糖對小鼠腸道菌群的影響Table 5 Effect of isomaltooligosaccharide on intestinal flora in CFU/g)

糞便中雙歧桿菌與腸桿菌數(shù)量的比值(B/E值)可作為腸道微生物定植抗力的指標應(yīng)用于臨床,該指標能從正反兩個方面來評價腸道菌群結(jié)構(gòu)的狀況,B/E值1以上表示腸道定植抗力正常,B/E值<1表示腸道定植抗力降低[14]。由表6可見,在飼喂受試物前后,各組小鼠的B/E值均大于1,說明小鼠腸道定植力正常。在飼喂前,各組小鼠B/E值無顯著差異。服用低聚異麥芽糖14 d后,對照組的B/E值與飼喂前沒有差異,低、高劑量組與飼喂前相比分別提高23%(p<0.05)和32%(p<0.01);與對照組相比,分別提高10%(p<0.05)和19%(p<0.01)。表5,表6的結(jié)果提示,低、高劑量的低聚異麥芽糖具有可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能。

表6 低聚異麥芽糖對小鼠腸道菌群B/E的影響Table 6 Effect of isomaltooligosaccharide on intestinal flora B/E in

2.4 對小鼠小腸推進率的影響

由表7可以看出,連續(xù)給與受試物21 d后,陰性對照組的小腸推進率高于模型對照組90%(p<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,低、高劑量組的小腸推進率分別提高83%(p<0.01)和98%(p<0.01)。結(jié)果提示:低、高劑量低聚異麥芽糖具有極顯著改善小鼠小腸推進率的功能。說明低聚異麥芽糖在促進腸道活動方面發(fā)揮積極作用。

表7 低聚異麥芽糖對小鼠小腸推進率的影響Table 7 Effects of isomaltooligosaccharide on intestinal propulsion in

2.5 對小鼠排便功能的影響

由表8可知,在連續(xù)給予受試物21 d之后,與陰性對照組比較,模型對照組的首次排黑便時間增加186.7%(p<0.01),6 h內(nèi)排黑便重量減少76.2%(p<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,低、高兩個劑量組首次排黑便時間分別降低83%(p<0.01)和86%(p<0.01);6 h內(nèi)排黑便重量分別提高79.4%(p<0.05)和126%(p<0.01),結(jié)果提示:低、高劑量的低聚異麥芽糖具有明顯改善便秘小鼠通便的功能,可有效緩解便秘,有通便的作用。

表8 低聚異麥芽糖對小鼠排首粒黑便時間,黑便重量的影響Table 8 Effects of isomaltooligosaccharide on the time of head and stool,the weight of feces in

3 結(jié)論

本文結(jié)果提示,低聚異麥芽糖可以有效增加小鼠腸道內(nèi)雙歧枝菌與乳桿菌的數(shù)量,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),治療便秘,無論體外還是在體內(nèi)腸道環(huán)境中都有利于益生菌的生長。體外結(jié)果顯示低聚異麥芽糖的作用可能呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

4 討論

目前,低聚異麥芽糖的需求逐漸增大,多年來,對其功能特性和生產(chǎn)方法[15-16]的研究已經(jīng)成為熱點[17]。低聚異麥芽糖由于其自身良好的物理和生物特性,在食品中可發(fā)揮良好的應(yīng)用[18]。目前低聚異麥芽糖已被應(yīng)用在飼料中[19-20],在保健品、飲料、乳制品、糖果、餅干小食品及焙烤食品中也逐漸得到了應(yīng)用,同時也作為新資源食品開始應(yīng)用[21]。本文研究提示低聚異麥芽糖在改善腸道菌群結(jié)構(gòu),治療便秘等方面有非常積極的影響。低聚異麥芽糖作為保健品、食品、飼料添加劑以及在醫(yī)藥方面將有良好的應(yīng)用前景,低聚異麥芽糖是一種非常有研究價值和發(fā)展?jié)撃艿囊嫔?。本實驗的不足之處是體內(nèi)實驗只設(shè)置了低、高兩個劑量組,差異不顯著,可設(shè)置多個劑量組進行進一步的低聚異麥芽糖含量對腸道菌群作用的研究。

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