黑木耳中多糖和類黃酮的隔氧提取及其協(xié)同抗氧化作用

王 鵬,郭 麗,姜 喆,郭艷莉,馬 雪,李 楊

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江綏化 152061)

黑木耳(Auriculariaauricular)又名黑菜、光木耳、云耳等,屬真菌類擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。黑木耳作為藥食同源真菌,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高,特別是黑木耳中多糖和類黃酮化合物具有抗氧化[1-4]、降血脂降膽固醇[1,5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7-8]等多種功效,逐漸得到人們的廣泛關(guān)注。

有關(guān)黑木耳抗氧化物質(zhì)的提取方法,主要集中在熱水浸提[9-10]、乙醇溶液浸提[11]、回流提取[8]、超聲波和微波輔助提取[9,12-13]開展研究,獲得的黑木耳抗氧化多糖和類黃酮具有較好的清除自由基的能力,可抑制脂質(zhì)過氧化,體外抗氧化效果顯著。但在提取過程中黑木耳多糖和類黃酮的穩(wěn)定性受氧氣等因素影響而產(chǎn)生損失,隔氧提取可有效防止物質(zhì)氧化,使生物活性物質(zhì)發(fā)揮卓越功效,但目前有關(guān)隔氧提取黑木耳抗氧化成分的研究還鮮有報(bào)道。

黑木耳多糖和類黃酮因其優(yōu)越的抗氧化功效成為天然抗氧化劑的良好來源,Peng等[14]建立小鼠皮膚光老化模型,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖可提高小鼠SOD和GSH-Px,延緩并抑制脂褐素和MDA的產(chǎn)生。張威[8]利用80%乙醇回流提取木耳黃酮和多酚,二者含量與抗氧化活性和抗腫瘤活性呈正相關(guān)。Fan等人[15]研究發(fā)現(xiàn),添加9%木耳多糖粉的面包感官質(zhì)量不變,木耳多糖粉在面包中具有較好的抗氧化效果。多種抗氧化活性物種聯(lián)合使用時(shí),其抗氧化活性往往較同濃度同劑量下的單一物質(zhì)抗氧化活性強(qiáng)。因此,研究黑木耳抗氧化物質(zhì)多糖和類黃酮之間的協(xié)同增效作用,尋找高效快速的復(fù)合方法對(duì)開發(fā)黑木耳新產(chǎn)品,提高其抗氧化效率具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)研究隔氧條件下超聲波輔助提取黑木耳多糖、黑木耳類黃酮,將黑木耳多糖和類黃酮組合,探討二者之間協(xié)同抗氧化作用,以期為開發(fā)綠色、高效的天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 黑龍江省綏化市;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH 美國(guó)sigma公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、六氰合鐵酸鉀、苯酚、鄰二氮菲、鄰苯三酚、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-600D 型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計(jì) 上海析譜儀器有限公司;80-2B型離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司;FW135型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 上海科靂儀器設(shè)備有限公司。

湖北襄陽大頭菜是湖北襄陽的農(nóng)家品種[1]，更是我國(guó)四大名腌菜之一。襄陽大頭菜歷史悠久，為諸葛亮隱居襄陽隆中時(shí)所創(chuàng)，在民間享有“諸葛菜”、“孔明菜”之美稱[2]。但是襄陽大頭菜的生產(chǎn)總體處于粗放式加工狀態(tài)，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會(huì)形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現(xiàn)，大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降直至失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取 用萬能粉碎機(jī)粉碎一定量的干燥黑木耳,過60目篩,稱取5.0 g黑木耳粉,加入雙蒸水(提取劑提前在0.1 MPa脫氣10 min),采用超聲波儀提取黑木耳多糖,提取條件:固液比1∶55 (w/v),超聲波功率200 W,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間40 min,選擇兩種提取環(huán)境,分別為隔氧提取和有氧提取。隔氧提取采用減壓提取,將樣品和提取溶劑按比例加入圓底燒瓶進(jìn)行抽真空處理,真空度為0.09 MPa。

1.2.2 黑木耳類黃酮的提取 取上述黑木耳干粉5.0 g,加入60%乙醇為提取劑(提取劑提前在0.1 MPa脫氣10 min),浸泡1 h,采用超聲波儀提取黑木耳黃酮。提取條件:固液比1∶40 (w/v),超聲波功率400W,提取溫度30 ℃,提取時(shí)間30 min,超聲波提取后于8000 r/min離心10 min,取上清液,沉淀重復(fù)提取一次,選擇兩種提取環(huán)境,分別為隔氧提取和有氧提取。隔氧提取采用減壓提取,將樣品和提取溶劑按比例加入圓底燒瓶進(jìn)行抽真空處理,真空度為0.09 MPa。

1.2.3 黑木耳多糖、類黃酮含量及抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 測(cè)定隔氧提取和有氧提取下黑木耳多糖和黑木耳類黃酮的含量。以提取劑雙蒸水和60%乙醇為陰性對(duì)照,以維生素C為陽性對(duì)照,分別測(cè)定兩種條件下黑木耳多糖和黑木耳類黃酮對(duì)抗氧化指標(biāo)還原能力,DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力的影響。

1.2.4 黑木耳多糖和類黃酮復(fù)配實(shí)驗(yàn)及協(xié)同抗氧化研究

1.2.4.1 黑木耳多糖和類黃酮復(fù)配比例的確定 經(jīng)上述1.2.3研究,確定隔氧提取條件為最佳提取條件,以此條件下提取的黑木耳多糖和黑木耳類黃酮進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn),以黑木耳多糖、黑木耳類黃酮、維生素 C和維生素E為對(duì)照,多糖:類黃酮(v/v)復(fù)配比例為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1。分別在反應(yīng)0 min和30 min進(jìn)行DPPH自由基清除能力測(cè)定,在反應(yīng)45 min時(shí)進(jìn)行羥自由基清除能力測(cè)定,分析不同復(fù)配條件下溶液清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。

1.2.4.2 黑木耳多糖和類黃酮復(fù)配抗氧化實(shí)驗(yàn) a.不同濃度復(fù)配液的清除自由基能力:確定多糖和類黃酮最佳復(fù)配比例后,研究不同濃度復(fù)配液的清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。取稀釋后的復(fù)配液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mL,定容至2 mL,分別在反應(yīng)0 min和30 min進(jìn)行DPPH自由基清除能力測(cè)定。取復(fù)配液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,定容至1 mL,在反應(yīng)45 min時(shí)進(jìn)行羥自由基清除能力測(cè)定。

b.復(fù)配液降溫過程清除自由基能力:研究復(fù)配液在降溫過程中清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。溫度分別為60、50、40、30 ℃,在反應(yīng)45 min時(shí)進(jìn)行羥自由基清除能力測(cè)定。

c.復(fù)配液在不同反應(yīng)時(shí)間清除自由基能力:研究復(fù)配液在不同反應(yīng)時(shí)間清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。清除DPPH自由基能力研究,反應(yīng)時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50、60 min。清除羥自由基能力研究反應(yīng)時(shí)間分別為30、45、60、75、90、120 min。

1.2.5.1 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定[16],按下式計(jì)算黑木耳多糖提取率。

計(jì)算公式為:

式中:X為多糖提取率,%。V1為樣品定容體積,mL;V2為測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積,mL;m1為經(jīng)稀釋后測(cè)定的多糖含量,mg;m2為黑木耳原料干重,g;N為稀釋倍數(shù)。

1.2.5.2 類黃酮含量的測(cè)定 參考Chun等[17]的方法,略做改動(dòng)。精密吸取濃度為12.8 mg/100 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于10 mL的容量瓶中,用60%乙醇溶液補(bǔ)充至5 mL,分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min;再分別加入10%的Al(NO3)溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL,用水稀釋到刻度,放置20 min,在510 nm處測(cè)定吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=5.179x+0.120(R2=0.997)。取一定稀釋倍數(shù)的黑木耳類黃酮樣液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定吸光度值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中類黃酮含量。

類黃酮含量計(jì)算公式為:

式中:V1為樣品定容體積,mL;V2為比色測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積,mL;m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中類黃酮含量,mg;m2為樣品質(zhì)量,g。

1.2.5.3 還原能力的測(cè)定 參考Lee等[18]的方法,略做改動(dòng)。取1 mL樣液(空白用1 mL蒸餾水代替,其他試劑依次同下)中,加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的六氰合鐵酸鉀(K3Fe(CN)6)和2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS pH6.6,0.2 mol/L),混勻后在50 ℃保溫20 min,然后加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸,混合后以3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Fecl3,混勻后在700 nm波長(zhǎng)下比色,記錄吸光度值。以25～200 μg/mL VC為標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線,以mg VC/mL表示鐵還原能力。

1.2.5.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照Yamaguchi等[19]的方法,略做改動(dòng)。精確配制1×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液,于0～4 ℃避光保存,備用。分別取待測(cè)溶液2 mL與DPPH溶液2 mL均勻混合,在黑暗中放置一定時(shí)間,于517 nm波長(zhǎng)處分別在30 min測(cè)定光密度值,空白組以無水乙醇取代DPPH,對(duì)照以無水乙醇取代樣品。清除率的計(jì)算方法如下:

式中：I表示DPPH自由基清除率,Ai為樣品組吸光度,Aj為空白組吸光度,Ac為對(duì)照組吸光度。

1.2.5.5 羥自由基清除能力的測(cè)定 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法進(jìn)行測(cè)定[20]。

1.2.5.6 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析,采用多元線性回歸分析方法進(jìn)行相關(guān)性分析。p<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式對(duì)黑木耳多糖和類黃酮提取率及抗氧化活性的影響

黑木耳多糖和類黃酮在隔氧條件下的提取率及抗氧化活性均高于有氧條件(見表1)。在隔氧條件下,多糖的提取率為3.85%,黑木耳類黃酮的提取率為4.2 mg/100 g;顯著高于有氧方式獲得的多糖和類黃酮提取率(p<0.05)。密閉隔氧提取的黑木耳類黃酮和多糖清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基能力的能力以及還原能力均高于有氧提取類黃酮和多糖(p<0.05)。

表1 隔氧和有氧提取對(duì)黑木耳多糖、類黃酮提取率及抗氧化活性對(duì)比(n=3)Table 1 Comparison of the content and antioxidant activity of polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricula by aerobic extraction and oxygen-resistant extraction(n=3)

由此可見,隔氧方式提取黑木耳中多糖和類黃酮,在氧含量較低的條件下,避免了二者的氧化降解,使其含量保持較高水平,進(jìn)而抗氧化活性效果更為突出[22]。

2.2 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮協(xié)同抗氧化研究

為了篩選出黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配液協(xié)同清除自由基效果,實(shí)驗(yàn)選擇一種以氮為中心的自由基DPPH自由基,一種活性氧自由基羥自由基,用兩種自由基清除效果來綜合評(píng)價(jià)黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配液協(xié)同抗氧化作用。

2.2.1 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配比例對(duì)清除DPPH自由基能力的影響 由圖1可見,初始0 min,不同配比黑木耳多糖(濃度為3 mg/mL)和黑木耳類黃酮(濃度為3 mg/mL)復(fù)配液之間對(duì)DPPH自由基清除能力差異不顯著(p>0.05)。30 min時(shí),隨著多糖體積的增加,類黃酮體積的減少,復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除能力依次分別增加了30.3%、41.6%、44.5%、47.5%和54.3%,可見隨著多糖含量的增加,復(fù)配液清除DPPH自由基能力逐漸增強(qiáng)。復(fù)配液配比多糖:類黃酮為9∶1和7∶3時(shí),DPPH自由基清除率較大,分別為100%和95%,二者之間差異顯著(p<0.05)。

圖1 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配后對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radicals scavenging ability of complex with polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricular注:不同小寫字母表示反應(yīng)初期0 min不同復(fù)配物清除DPPH自由基能力差異顯著(p<0.05);不同大寫字母表示反應(yīng)30 min不同復(fù)配物清除DPPH自由基能力差異顯著(p<0.05)。

由圖2可見,不同配比復(fù)配液之間對(duì)羥自由基清除能力差異顯著(p<0.05),當(dāng)黑木耳多糖∶黑木耳類黃酮=7∶3時(shí),羥自由基清除率最大,為62%。復(fù)配液中多糖碳?xì)滏溕系臍湓优c羥自由基結(jié)合成水,而碳原子上剩下的單電子可繼續(xù)氧化形成過氧自由基,進(jìn)一步分解,阻止活性氧等新自由基形成,阻斷連鎖自由基擴(kuò)增途徑,從而達(dá)到抗氧化效果[23]。綜合復(fù)配液對(duì)DPPH自由基、羥自由基清除能力的影響,確定黑木耳多糖∶黑木耳類黃酮=7∶3為最佳配比。

圖2 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配后對(duì)羥自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radicals scavenging ability of complex with polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricular注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 黑木耳多糖和類黃酮復(fù)配抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 不同濃度復(fù)配液的抗氧化能力 由圖3、圖4可見,隨著復(fù)配液濃度的增加,復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力逐漸增加。復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除能力在0 min和30 min時(shí)差異顯著(p<0.05),反應(yīng)30 min復(fù)配液濃度為0.72×10-3mg/mL時(shí),清除率最高為88.65%。復(fù)配液濃度為0.432×10-3mg/mL以后,對(duì)DPPH自由基清除率維持穩(wěn)定,差異不顯著(p>0.05)。

圖3 復(fù)配液濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of complex concentration on DPPH radical scavenging ability

由圖4可見,當(dāng)復(fù)配液濃度為3.6×10-3mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率達(dá)55.6%,隨著復(fù)配液濃度的增大,羥自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),復(fù)配液濃度在三個(gè)范圍區(qū)間(1.2～2.4×10-3mg/mL,3.6～4.8×10-3mg/mL,6.0×10-3mg/mL)差異顯著(p<0.05)。

圖4 復(fù)配液濃度對(duì)羥自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of complex concentration on hydroxyl radical scavenging ability

2.2.2.2 降溫過程中復(fù)配液抗氧化能力的變化 圖5為降溫過程復(fù)配液的DPPH自由基清除能力變化曲線。60 ℃條件下反應(yīng)20 min時(shí),復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng),之后隨時(shí)間延長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。溫度下降至40 ℃和50 ℃反應(yīng)40 min后,復(fù)配液的DPPH自由基清除能力達(dá)到最高,分別為78.9%、80.6%。溫度下降至30 ℃,復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除率最低,與其他溫度相比差異顯著(p<0.05)。

圖5 不同溫度下復(fù)配液清除DPPH自由基的能力Fig.5 DPPH radical scavenging ability of complex at different temperature

由圖6可見,隨著反應(yīng)溫度的降低,復(fù)配液對(duì)羥自由基清除能力呈下降趨勢(shì),各溫度之間羥自由基清除率差異顯著(p<0.05),在60 ℃時(shí),羥自由基清除率為91.6%,30 ℃時(shí)清除率為21.4%。

圖6 不同溫度下復(fù)配液清除羥自由基的能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging ability of complex at different temperature

2.2.2.3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)配液抗氧化能力的影響 由圖7可見,復(fù)配液對(duì)DPPH自由基清除能力隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng),在10～60 min內(nèi)DPPH自由基清除率變化幅度較小,但與初始0 min相比DPPH自由基清除率差異顯著(p<0.05)。復(fù)配液濃度與DPPH自由基的清除能力呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。在反應(yīng)60 min時(shí),0.02×10-3mg/mL、0.1×10-3mg/mL、0.3×10-3mg/mL濃度的復(fù)配液對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大,分別為53.9%、71.6%、86.5%。

圖7 不同反應(yīng)時(shí)間下復(fù)配液清除DPPH自由基能力Fig.7 DPPH radical scavenging ability of complex in different reaction time

由圖8可見,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),復(fù)配液對(duì)羥自由基的清除能力呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為75 min時(shí),清除率上升至最高,為98.9%;在反應(yīng)90 min和120 min時(shí),羥自由基的清除率維持穩(wěn)定,差異不顯著(p>0.05),與其他時(shí)間處理相比差異顯著(p<0.05)。

圖8 不同反應(yīng)時(shí)間下復(fù)配液清除羥自由基能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging ability of complex in different reaction time

3 結(jié)論

與有氧提取相比,隔氧提取獲得的黑木耳多糖、黑木耳類黃酮含量較高,分別為3.85%、4.2 mg/100 g;同時(shí)清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基能力,還原能力較強(qiáng)。

黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配比例為7∶3時(shí),清除DPPH自由基能力為95%,清除羥自由基能力為62%。隨著黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復(fù)配液濃度增加,對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除能力增大;降溫過程中,40 ℃和50 ℃反應(yīng)40 min后,對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除能力達(dá)到最大,二者差異不顯著(p>0.05)。0.3×10-3mg/mL濃度的復(fù)配液對(duì)DPPH自由基的清除率在60 min時(shí)達(dá)到最大,為86.5%,75 min時(shí),復(fù)配液對(duì)羥自由基清除率上升至最高,為98.9%。

綜上,經(jīng)過隔氧條件提取得到的黑木耳多糖和類黃酮,其提取率及抗氧化活性均高于有氧條件提取物;黑木耳多糖和類黃酮復(fù)配品可提高對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除效率,具有協(xié)同抗氧化作用。

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