DC-GPC3聯(lián)合CIK細(xì)胞的體外抗肝癌作用

韓秋青 ，姜錦 ，王玉亮

肝癌是全球第五大惡性腫瘤，具有很高的發(fā)病率和死亡率，全球每年約有62萬患者被新診斷為肝癌［1］。由于中國人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率較高，使得我國占到了世界所有新診斷肝癌病例的55%，成為全世界肝癌最高發(fā)的地區(qū)之一［2］。目前抗腫瘤生物免疫治療模式在國內(nèi)外備受關(guān)注，其對于清除微小的轉(zhuǎn)移灶和隱匿瘤，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有較好的效果［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)通過體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK）共孵育，可以有效提高CIK細(xì)胞的增殖能力及廣譜抗腫瘤能力［4］，但缺乏特異識別腫瘤細(xì)胞的特性。研究顯示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC3）可作為一個新的肝癌診斷、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，以及肝癌生物免疫治療新的靶點(diǎn)［5］。本研究擬將GPC3基因轉(zhuǎn)染DC所得到的DC-GPC3與CIK共培養(yǎng)，觀察其生物活性及體外抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2和SK-Hep-1，白細(xì)胞介素（IL）-2依賴細(xì)胞株CTLL-2由衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于液氮凍存。人DC、DC-GPC3及CIK由衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于液氮凍存。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；重組粒單-集落刺激因子（GM-CSF）、IL-4、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-2、抗 CD3 單抗、異硫氰酸熒光素/藻紅蛋白（FITC/PE）標(biāo)記的鼠抗人CD單抗（美國BD公司）；IL-2、干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒（美國Promega公司）。FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；凈化工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；多模式微孔板檢測儀（美國PE公司）。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測人DC、DC-GPC3以及CIK免疫表型 復(fù)蘇液氮罐凍存人DC、DC-GPC3及CIK，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106細(xì)胞/mL，按各流式抗體試劑說明書操作，檢測DC、DC-GPC3及 CIK 特異表面標(biāo)志：DC（CD80、CD83、CD86）、CIK（CD3+CD8+、CD3+CD56+）。

1.3 DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng) 以DC-GPC3與CIK細(xì)胞按1∶5的比例混合，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，獲得DCIK-GPC3作為實(shí)驗(yàn)組，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL；以DC與CIK細(xì)胞按1∶5的比例混合，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，獲得DCIK作為對照組，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL。同時設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞作為空白對照組，動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測人CIK、DCIK及DCIK-GPC3免疫表型 按各流式抗體試劑說明書操作，檢測CIK、DCIK及DCIK-GPC3特異表面標(biāo)志CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2生物活性 取對數(shù)生長期IL-2依賴細(xì)胞株（CTLL-2），用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μL，每孔分別加入CIK、DCIK及DCIK-GPC3細(xì)胞培養(yǎng)上清液50μL或稀釋的IL-2標(biāo)準(zhǔn)品，并設(shè)3個平行孔，以1640培養(yǎng)液做陰性對照。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入20μL MTT（5 g/L），再培養(yǎng)4 h，用DMSO溶解孔中活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚結(jié)晶，待結(jié)晶完全溶解后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于多模式微孔板檢測儀，測定570 nm波長處各孔的光密度（OD）值，根據(jù)稀釋IL-2標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，計算出各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2生物活性。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ濃度檢測 使用ELISA試劑盒測定CIK、DCIK及DCIK-GPC3細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2、IFN-γ濃度，按照說明書操作。

1.7 細(xì)胞毒活性測定 分別以DCIK-GPC3、DCIK及CIK作為效應(yīng)細(xì)胞，以對數(shù)生長期GPC3陽性的HepG2作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按20∶1、50∶1比例混合接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，采用LDH釋放法按操作說明書檢測效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。同時以對數(shù)生長期GPC3陰性的SK-Hep-1作為對照靶細(xì)胞，與DCIK-GPC3、DCIK按1∶20比例混合，采用LDH釋放法檢測細(xì)胞毒活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC及DC-GPC3免疫表型 DC表面CD80陽性細(xì)胞所占比例為82%，CD83陽性細(xì)胞所占比例為78%，CD86陽性細(xì)胞所占比例為86%；DC-GPC3表面CD80陽性細(xì)胞所占比例為83%，CD83陽性細(xì)胞所占比例為80%，CD86陽性細(xì)胞所占比例為87%，見圖 1。

Fig.1 The phenotypic characteristics of DC and DC-GPC3圖1DC及DC-GPC3免疫表型

2.2 各組效應(yīng)細(xì)胞免疫表型 DCIK-GPC3表面CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞百分比較DCIK及CIK明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為39.983、65.371，P＜0.01），見圖 2。

2.3 各組效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-2生物活性及濃度檢測 各組效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-2生物活性及濃度水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為31.414、110.780，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培養(yǎng)上清液分泌 IL-2生物活性及濃度依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3、4。

Fig.2 The phenotypic characteristics of effector cells圖2 各組效應(yīng)細(xì)胞免疫表型

Fig.3 The biological activity of secreted IL-2 of effector cells in supernatants圖3 各組效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌IL-2生物活性

Fig.4 The concentration of secreted IL-2 of effector cells in supernatants圖4 各組效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌IL-2濃度

2.4 各組效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ濃度比較 各組效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=30.636，P＜0.01）。CIK、DCIK、DCIK-GPC3 培養(yǎng)上清液分泌IFN-γ濃度依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

Fig.5 The concentration of secreted IFN-γ of effector cells in supernatants圖5 各組效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌IFN-γ濃度

2.5 各組效應(yīng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞毒活性比較 在20∶1及50∶1效靶比，各組效應(yīng)細(xì)胞對GPC3陽性的HepG2細(xì)胞毒活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為28.127、34.088，P＜0.01），CIK、DCIK、DCIK-GPC3對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。而在20∶1效靶比，DCIK-GPC3對 GPC3陰性的 SKHep-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性與DCIK比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（34.5%±3.1%vs.35.5%±3.7%，n=4，t=0.414，P＞0.05）。

Fig.6 The cytotoxic activity against HepG2 of effector cells圖6 各組效應(yīng)細(xì)胞對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

3 討論

3.1 GPC3作為肝癌治療靶點(diǎn) 近年國內(nèi)外研究已證實(shí)，GPC3可成為一個新的肝癌診斷、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，以及肝癌生物免疫治療新的靶點(diǎn)［5］。如Bi等［6］將人源化抗GPC3抗體的單鏈可變片段與抗CD3抗體融合來制備靶向GPC3和CD3雙特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)劑，結(jié)果顯示，其在體內(nèi)外高效、特異性殺傷GPC3陽性表達(dá)的人類肝癌細(xì)胞。Sawada等［7］進(jìn)行了 GPC3 肽疫苗作為肝細(xì)胞肝癌（HCC）患者的輔助治療的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，手術(shù)加疫苗接種的HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率低于單純接受手術(shù)的患者。GPC3肽疫苗可降低GPC3陽性腫瘤患者的1年復(fù)發(fā)率。因此，以GPC3為分子靶點(diǎn)的治療是HCC治療的有希望的候選方法。

3.2 DCIK-GPC3免疫表型 DCIK是DC與CIK共培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)效應(yīng)細(xì)胞，成熟DC抑制了CD4+CD25+Treg細(xì)胞，后者可以明顯抑制CIK中的CD3+CD8+和CD3+CD56+效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮活性。加入DC可以有效消除這種免疫抑制效應(yīng)，DCIK細(xì)胞的增殖以及殺傷活性明顯增強(qiáng)。因此，將CIK和DC聯(lián)合治療惡性腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T細(xì)胞的免疫無能，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［8-9］。CIK表型以CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞為主，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DCIK-GPC3免疫表型CD3+CD8+和CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞百分比較DCIK及CIK細(xì)胞明顯增高，這表明DC-GPC3和CIK細(xì)胞之間存在很重要的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系，CIK細(xì)胞可以識別成熟的DC-GPC3，DC-GPC3又可以促進(jìn)CIK效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增多，這可以保證了DCIK-GPC3細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。

3.3 DCIK-GPC3體外抗肝癌作用 本課題組前期研究證實(shí)，DCIK-GPC3效應(yīng)細(xì)胞可明顯抑制肝癌移植瘤生長［10］，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，隨著效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例增加，各組對GPC3陽性的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著增加；在相同效靶比條件下，DCIK-GPC3、DCIK對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較CIK顯著提高，其中以DCIK-GPC3的細(xì)胞毒活性最為顯著。進(jìn)一步在相同效靶比條件下，DCIK-GPC3對GPC3陰性的SK-Hep-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性與DCIK相比并無顯著增高。這提示靶向GPC3的DCIK-GPC3對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)依賴GPC3分子的表達(dá)，具有較高的特異性，對高表達(dá)GPC3抗原肝癌細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力，從而彌補(bǔ)了DCIK非特異性殺傷的不足。本研究結(jié)果顯示，與DCIK及CIK相比，DCIK-GPC3培養(yǎng)上清液中IL-2生物活性、濃度以及上清液中IFN-γ濃度水平均顯著升高，提示DCIK-GPC3高效釋放的生物活性物質(zhì)IL-2及IFN-γ可正反饋促進(jìn)DCIK-GPC3的高度活化，從而顯著增強(qiáng)CIK效應(yīng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的特異性直接殺傷作用。

總之，CIK與DC-GPC3共培養(yǎng)可獲得更強(qiáng)的特異性殺傷肝癌細(xì)胞活性，本研究為DCIK-GPC3治療肝癌的臨床轉(zhuǎn)化提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Zhu RX，Seto WK，Lai CL，et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the Asia-Pacific region［J］.Gut Liver，2016，10（3）：332-339.doi：10.5009/gnl15257.

［2］Wang FS，F(xiàn)an JG，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease：the major impact of China［J］.Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.doi：10.1002/hep.27406.

［3］Mittica G，Capellero S，Genta S，et al.Adoptive immunotherapy against ovarian cancer［J］.J Ovarian Res，2016，9（1）：30.doi：10.1186/s13048-016-0236-9.

［4］Mesiano G，Todorovic M，Gammaitoni L，et al.Cytokine-induced killer（CIK）cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors［J］.Expert Opin Biol Ther，2012，12（6）：673-684.doi：10.1517/14712598.2012.675323.

［5］Zhou F，Shang W，Yu X，et al.Glypican-3：A promising biomarker for hepatocellular carcinoma diagnosis and treatment［J］.Med Res Rev，2017 Jun 16.doi：10.1002/med.21455.

［6］Bi Y，Jiang H，Wang P，et al.Treatment of hepatocellular carcinoma with a GPC3-targeted bispecific T cell engager［J］.Oncotarget，2017，8（32）：52866-52876.doi：10.18632/oncotarget.17905.

［7］Sawada Y，Yoshikawa T，Ofuji K，et al.Phase II study of the GPC3-derived peptide vaccine as an adjuvant therapy for hepatocellular carcinoma patients［J］.Oncoimmunology，2016，5（5）：e1129483.doi：10.1080/2162402X.2015.1129483.

［8］Mu Y，Zhou CH，Chen SF，et al.Effectiveness and safety of chemotherapy combined with cytokine-induced killer cell/dendritic cell-cytokine-induced killer cell therapy for treatment of gastric cancer in China：A systematic review and meta-analysis［J］.Cytotherapy，2016，18（9）：1162-1177.doi：10.1016/j.jcyt.2016.05.015.

［9］Zhang Y，Zhang X，Zhang A，et al.Clinical applications of dendritic cells-cytokine-induced killer cells mediated immunotherapy for pancreatic cancer：an up-to-date meta-analysis［J］.Onco Targets Ther，2017，10：4173-4192.doi：10.2147/OTT.S143382.

［10］靳燕宇，王玉亮，宋揚(yáng)，等.DC-GPC3聯(lián)合CIK細(xì)胞體內(nèi)抗肝癌作用［J］.天津醫(yī)藥，2017，45（10）：1021-1024.Jin YY，Wang YL，Song Y，et al.Antitumor effect of DC-GPC3 cocultured with CIK on hepatocellular carcinoma in vivo［J］.Tianjin Med J，2017，45（10）：1021-1024.doi：10.11958/20170626.