組織工程肌腱種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子的研究進(jìn)展

孫銀鳳 張國(guó)榮

【摘要】 組織工程肌腱作為肌腱損傷修復(fù)的重要方法，已成為研究熱點(diǎn)。本文以“組織工程肌腱、種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子”為主題詞，檢索CNKI的相關(guān)文獻(xiàn)。納入具有原創(chuàng)性、論點(diǎn)論據(jù)可靠的實(shí)驗(yàn)文章，排除重復(fù)性研究，選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的40篇文獻(xiàn)進(jìn)行分析。對(duì)種子細(xì)胞的種類(lèi)、支架材料的選擇以及誘導(dǎo)肌腱形成因素進(jìn)行闡述，促進(jìn)每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的優(yōu)化，以利于組織工程肌腱的成熟構(gòu)建。

【關(guān)鍵詞】 組織工程肌腱； 種子細(xì)胞； 支架材料； 生長(zhǎng)因子

【Abstract】 Tissue engineered tendon has become a key approach to repair tendon injury.Consequently，the study on it is gaining more and more popularity.“Tissue engineered tendon，seed cell，scaffold material， growth factor” are inputted as the Chinese search words in CNKI to retrieve relevant literature.On this basis，the original experimental articles， in which the arguments and opinions are reliable，that can be further analyzed amounts to 40.Surely，this number excludes the overlapping ones.Based on the types of seed cells，the selection of scaffold materials，as well as the elaboration to the factors that induce the forming of tendons，this research aims at promoting the optimization of each key point，which is conducive to the mature building of the tissue engineered tendons.

【Key words】 Tissue engineered tendon； Seed cells； Scaffold materials； Growth factor

First-authors address：The School of Clinical Medicine，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.04.039

肌腱位于肌肉與骨骼之間，起力的傳導(dǎo)作用。肌腱內(nèi)細(xì)胞、血管較少，含大量縱行排列的膠原纖維。肌腱損傷在臨床屬常見(jiàn)疾病，損傷后愈合較慢，很難恢復(fù)到正常肌腱一樣的抗拉伸強(qiáng)度。傳統(tǒng)移植治療因存在移植物來(lái)源有限，免疫排斥等問(wèn)題，修復(fù)效果不理想。組織工程肌腱為肌腱損傷修復(fù)提供了一種新方法，其是將種子細(xì)胞種植于支架材料上，體外培養(yǎng)后移植到缺損部位，隨著支架材料的降解，細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，形成新的肌腱組織，達(dá)到生物意義上的完全修復(fù)。

1 種子細(xì)胞

1.1 自體肌腱細(xì)胞 肌腱細(xì)胞作為肌腱組織固有細(xì)胞，是人們首先想到的組織工程肌腱種子細(xì)胞。1971年，Jimenez等[1]成功在體外培養(yǎng)雞胚腱細(xì)胞，此后，對(duì)肌腱細(xì)胞的研究逐漸深入。張兆鋒等[2]體外培養(yǎng)成年家雞肌腱細(xì)胞，種植于支架材料，回植于家雞體內(nèi)，培養(yǎng)出大體、組織學(xué)結(jié)構(gòu)均與正常肌腱相似的組織。但肌腱細(xì)胞增殖能力較差，尤其是在體外培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)數(shù)次傳代，細(xì)胞逐漸老化。楊志明等[3]發(fā)現(xiàn)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）能加速肌腱細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。肌腱細(xì)胞如能獲得穩(wěn)定的增殖能力則可以成為組織工程肌腱種子細(xì)胞。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）具有多向分化潛能，可以向骨、軟骨、肌腱、脂肪等組織分化，其易擴(kuò)增數(shù)量，可以多次傳代并保持分化能力。Dressler等[4]取同一兔不同年齡時(shí)期的MSCs種植于Ⅰ型膠原支架，并回植于兔體內(nèi)，結(jié)果顯示所形成的肌腱樣組織在組織學(xué)及力學(xué)性能方面都無(wú)明顯差異，證明MSCs的增殖分化能力不受供體年齡限制。曲彥隆等[5]研究表明給予MSCs應(yīng)力刺激能夠加速細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。姜任武等[6]將培養(yǎng)的MSCs種植于生物材料上，將此復(fù)合物回植于跟腱缺損部位，8周后發(fā)現(xiàn)移植物與受體肌腱連接完好，不形成瘢痕。因此，MSCs可以作為組織工程肌腱的種子細(xì)胞。

1.3 皮膚成纖維細(xì)胞 皮膚成纖維細(xì)胞與肌腱細(xì)胞均起源于中胚層，它取材方便、擴(kuò)增能力強(qiáng)，具備成為組織工程肌腱種子細(xì)胞的可能。有實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)肌腱細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，對(duì)它們的生物學(xué)特性進(jìn)行對(duì)比分析。兩種細(xì)胞未貼壁前均呈圓形，貼壁后呈梭形或多邊形。貼壁后肌腱細(xì)胞群體大致趨于一致，成纖維細(xì)胞排列呈不規(guī)則狀態(tài)[7]。董志寧等[8]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皮膚成纖維細(xì)胞能很好地貼附于支架材料生長(zhǎng)，但在增殖過(guò)程中，排列紊亂，修復(fù)部位易出現(xiàn)骨化。肌腱細(xì)胞合成Ⅰ型膠原，成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原。如果能對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行改造，使之成為組織工程肌腱的種子細(xì)胞，則能解決種子細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題。

2 支架材料

2.1 天然高分子材料 天然高分子材料，主要有膠原、蠶絲和小腸黏膜下層（Small Intestinal Submucosa，SIS）。他們具有天然可降解性，一般都無(wú)毒，親水性及細(xì)胞親和性良好，但缺點(diǎn)是力學(xué)性能差、降解速度快、加工性能差[9]。

膠原由粗大的膠原纖維束平行排列而成，其方向與所受牽引力一致，具有良好的力學(xué)性能。膠原蛋白抗原性低、生物相容性好，可參與組織的愈合過(guò)程，是一種較理想的組織工程肌腱支架材料。

蠶絲具有獨(dú)特的機(jī)械性能，其支鏈有生長(zhǎng)和黏附因子，在醫(yī)療領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。田旭等[10]以羅曼雞的胚胎腱細(xì)胞和蠶絲構(gòu)建組織工程肌腱，將其移植到肌腱缺損部位，在不同時(shí)間點(diǎn)做組織學(xué)、生物力學(xué)等檢查，結(jié)果表明蠶絲對(duì)肌腱細(xì)胞吸附明顯，生物相容性好，具備良好力學(xué)性能，可能會(huì)在肌腱損傷修復(fù)方面發(fā)揮巨大潛能。

小腸黏膜下層主要成分為細(xì)胞外基質(zhì)，親水性強(qiáng)，利于細(xì)胞從培養(yǎng)體系中攝取營(yíng)養(yǎng)[11]。它對(duì)局部微環(huán)境具有應(yīng)答性，能促進(jìn)組織重建，是一種適合細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)和增殖的良好支架材料[12]。它還含有多種生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）。這些生長(zhǎng)因子在促進(jìn)種子細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分泌和工程化組織塑形中發(fā)揮著重要作用。劉忠玉等[13]將培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞接種在SIS上，形成細(xì)胞-支架復(fù)合物，并將其回植于肌腱缺損處，結(jié)果顯示SIS具有良好的生物相容性。郭平等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)小腸黏膜下層對(duì)肌腱細(xì)胞無(wú)毒，細(xì)胞黏附性良好，但抗拉強(qiáng)度較弱。孫文才等[15]利用豬小腸黏膜下層和羅曼雞的雞胚趾深屈肌肌腱細(xì)胞聯(lián)合構(gòu)建組織工程肌腱，并將其移植到成年羅曼雞的肌腱缺損部位，植入后3、6、9周檢測(cè)植入材料的最大拉伸強(qiáng)度優(yōu)于單純小腸黏膜下層。

2.2 人工合成高分子材料 目前，組織工程肌腱常用的人工合成高分子材料主要有聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（PLGA）3種，它們的優(yōu)點(diǎn)是來(lái)源廣、易加工、可降解，缺點(diǎn)是細(xì)胞親水性差，細(xì)胞附著力差等問(wèn)題。

郭正等[16]對(duì)PGA和PLA進(jìn)行體外降解和細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PGA適合細(xì)胞黏附和增殖，但降解速度較快；PLA降解速率較慢，但細(xì)胞不能在支架上較好黏附和增殖。因此，兩者單獨(dú)使用受到限制，要想滿足細(xì)胞的增殖黏附和支架降解過(guò)程中的力學(xué)要求，可以將PGA與PLA共聚，得到機(jī)械性能好，柔韌性好，降解速度可控的組織工程肌腱支架。

2.3 復(fù)合材料 由于天然材料和人工合成材料均具有明顯局限性，復(fù)合材料則可結(jié)合二者優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)材料性能。龍劍虹等[17]將MSCs接種于膠原-PGA復(fù)合材料上，在體外構(gòu)建組織工程肌腱并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈梭形，能適應(yīng)材料伸展，沿支架材料大致平行排列。

3 生長(zhǎng)因子

3.1 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）是重要的有絲分裂促進(jìn)因子，肌腱愈合過(guò)程中bFGF能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞定向分化[18]。Sahoo等[19]將bFGF與蠶絲支架復(fù)合，再與間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，3周后觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞增殖明顯，生物力學(xué)性能明顯優(yōu)于未復(fù)合bFGF的對(duì)照組。研究發(fā)現(xiàn)bFGF對(duì)損傷肌腱的重塑及提高生物力學(xué)強(qiáng)度方面具有重要作用[20]。但它有加重肌腱粘連的傾向，可能與鞘內(nèi)肌腱細(xì)胞的膠原分泌有關(guān)，具體機(jī)制尚在研究中[21]。

3.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白12 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）是一組疏水性酸性蛋白，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白12（BMP-12）與骨形成無(wú)關(guān)，但具有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱和韌帶組織分化的能力。正常肌腱的腱鞘內(nèi)膜及血管周?chē)M織中均可檢測(cè)到BMP-12。付文玉等[22]研究表明，肌腱損傷早期，BMP-12能促進(jìn)缺損組織周?chē)旒?xì)胞增殖，膠原蛋白合成旺盛。蔡榮輝等[23]將培養(yǎng)的家兔MSCs經(jīng)BMP-12誘導(dǎo)分化，接種至Ⅰ型膠原-PGA上，并回植于肌腱缺損處，發(fā)現(xiàn)經(jīng)BMP-12處理的MSCs，細(xì)胞增殖明顯加快，并向肌腱細(xì)胞分化，進(jìn)一步證實(shí)了BMP-12可作為誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子。

3.3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming Growth Factor β，TGFβ）是一組多功能蛋白多肽，含TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者在肌腱韌帶損傷修復(fù)中扮演不同角色。其中，TGF-β1在體內(nèi)分布廣泛，能有效促進(jìn)損傷肌腱韌帶的修復(fù)，是目前研究的熱點(diǎn)。但TGF-β1是韌帶平滑肌肌動(dòng)蛋白ɑ（ɑ-SMA）分泌的信號(hào)分子，激活該信號(hào)通路能促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化，引起組織纖維化，瘢痕及粘連的形成[24]。有研究顯示，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）能顯著減少TGF-β1誘導(dǎo)的ɑ-SMA表達(dá)，可以防治肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的瘢痕粘連問(wèn)題[25]。

組織工程是近年來(lái)迅速發(fā)展的一個(gè)嶄新領(lǐng)域，經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的不斷研究，取得了令人矚目的成就。組織工程肌腱的發(fā)展，為臨床肌腱損傷修復(fù)帶來(lái)曙光，但目前仍存在許多問(wèn)題。

種子細(xì)胞來(lái)源有限，如何實(shí)現(xiàn)大量穩(wěn)定擴(kuò)增；異體細(xì)胞如何減輕免疫排斥反應(yīng)；細(xì)胞在支架材料上的黏附、增殖和分化；細(xì)胞增殖與支架材料降解同步化；天然材料力學(xué)強(qiáng)度差，合成材料降解過(guò)程中局部酸性產(chǎn)物蓄積；構(gòu)造模擬人體的三維張力環(huán)境；如何適時(shí)、適量地運(yùn)用生長(zhǎng)因子，采用多種生長(zhǎng)因子時(shí)如何發(fā)揮其協(xié)同作用等問(wèn)題都有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-11-09） （本文編輯：周亞杰）