毛細(xì)管電泳法測定不同體細(xì)胞數(shù)的原料乳的蛋白組成及含量

張 明,任發(fā)政,方 冰,張 昊,郭慧媛

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,教育部北京市共建功能乳品重點實驗室,北京100083;4.河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)中心，河北三河 065200)

原料乳中含有少量體細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞(35%～79%),淋巴細(xì)胞(16%～28%),多形核中性白細(xì)胞(3%～26%)和乳腺組織脫落的上皮細(xì)胞(2%～15%)[1-2]。體細(xì)胞數(shù)即每毫升乳中所含的體細(xì)胞總數(shù)，是衡量奶牛乳房健康狀況和原料乳品質(zhì)的一項重要指標(biāo)。

體細(xì)胞數(shù)量(Somatic Cell Count,SCC)的高低對原料乳蛋白質(zhì)組成和含量有明顯影響。由于來自血液中的白細(xì)胞中包含了多種蛋白水解酶,如組織蛋白酶B、C、D及L等[3],直接導(dǎo)致乳中乳清蛋白和酪蛋白含量的劇烈變化。而蛋白質(zhì)組分的變化也直接影響到原料乳的加工特性。研究表明,原料乳中SSC的增加會導(dǎo)致干酪產(chǎn)量的降低,延長凝乳時間,降低凝乳穩(wěn)定性;原料乳的SSC的增加引發(fā)的酪蛋白水解反應(yīng)會使得液態(tài)奶產(chǎn)生苦味[1]。因此,明確原料乳SCC數(shù)量與蛋白質(zhì)含量組成之間的相互關(guān)系,對指導(dǎo)企業(yè)原料乳的收購至關(guān)重要[4-5]。然而,電泳法、高效液相色譜法等傳統(tǒng)蛋白分析方法普遍存在,但存在分離效率差、分辨率低等問題,無法對原料乳主要的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的分離和定量測定。

毛細(xì)管電泳是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。牛乳中主要的蛋白組成[6],甚至乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白及其重要降解產(chǎn)物para-κ-酪蛋白[7-9]均可經(jīng)由毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法鑒別。本研究首先建立了乳蛋白的毛細(xì)管電泳分析方法;并采集了不同SCC數(shù)量原料乳,分析不同SCC數(shù)量的原料乳蛋白質(zhì)含量、組成的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料乳 來自北京三元集團(tuán)綠荷渠頭牧場的32頭荷斯坦乳牛;α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)、α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)和κ-酪蛋白(κ-CN)標(biāo)準(zhǔn)品及二硫蘇糖醇 美國Sigma公司;尿素 純度大于99.5%,美國Amresco公司;大豆分離蛋白(純度大于90%) 河南正興食品添加劑有限公司;水解膠原蛋白(純度大于95%) 鄭州藍(lán)天生物科技有限公司。

FossMatic 5000體細(xì)胞分析測定儀 丹麥Foss公司;P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀及未涂層毛細(xì)管柱 美國Beckman公司;低溫離心機 美國Thermo Scientific 公司;超純水儀 ELGA Lab Water公司;KH5200DB型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;精密酸度計 北京哈納科儀科技有限公司。

樣品緩沖液:40 mmol/L磷酸二氫鈉,0.1% DTT,6 mol/L尿素,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,定容。用0.45 μm水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾,20 kHz超聲10 min,備用。

電泳緩沖液:20 mmol/L磷酸二氫鈉,0.05%羥丙基甲基纖維素,6 mol/L尿素,用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.75,定容。用0.45 μm水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾,20 kHz超聲10 min,備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料乳樣品的采集及制備 將待測牛乳樣品在4 ℃條件下4000 r/min離心20 min除去脂肪,取一定體積的下層脫脂乳,與樣品緩沖液按體積比1∶4混合,室溫放置1 h后用0.45 μm的水系濾膜過濾,備用。

1.2.2 原料乳的分類 利用體細(xì)胞分析測定儀測定每頭牛所產(chǎn)牛乳的體細(xì)胞數(shù)。根據(jù)測定結(jié)果,將原料乳按照體細(xì)胞數(shù)含量分為四組:小于3萬個/mL、20～25萬個/mL、55～60萬個/mL及100～130萬個/mL。

1.2.3 毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離條件 參照文獻(xiàn)[10]，非涂層毛細(xì)管(60 cm×50 μm,有效長度:50 cm),羥丙基甲基纖維素為添加物,設(shè)置柱溫為35 ℃,紫外檢測波長為214 nm,選擇pH2.75的磷酸鹽緩沖液為樣品緩沖液及上樣緩沖液,壓力進(jìn)樣方式為1.0 psi、10 s,分離電壓設(shè)為25 kV。

1.2.4 牛乳樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳測定 取處理好的牛乳樣品1 mL于進(jìn)樣瓶中,按照優(yōu)化好的電泳條件進(jìn)行測定,每個樣品重復(fù)測定兩次。毛細(xì)管使用前的活化以及實驗過程中毛細(xì)管的清洗程序如下[8]。

毛細(xì)管使用前的活化程序:調(diào)節(jié)壓力至20 psi,先后用0.1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCI溶液和超純水沖洗10、5和2 min。

樣品測定開始前,毛細(xì)管的沖洗程序為:調(diào)節(jié)壓力至70 psi,先后用超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水、電泳緩沖液分別沖洗1、2、2和5 min。

樣品測定結(jié)束后,毛細(xì)管的沖洗程序:調(diào)節(jié)壓力至70 psi,用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗10 min,再調(diào)節(jié)壓力至50 psi,先后用0.1 mol/L HCI溶液和超純水沖洗10和2 min。

1.2.5 牛乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜的建立 將實驗樣品按照優(yōu)化好的電泳條件進(jìn)行測定,得到各自的電泳圖譜,并按以下步驟對電泳圖譜進(jìn)行處理:對獲得的一系列電泳圖譜進(jìn)行評價并得到牛乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳對照圖譜;選擇各譜圖中峰共有率不低于70%的作為確定指紋峰的依據(jù);采用牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對電泳圖譜中的主要乳清蛋白(α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)和酪蛋白(α-、β-和κ-酪蛋白)進(jìn)行標(biāo)定;并結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道[1,8],確定出這幾種蛋白峰之外的電泳峰所代表的乳蛋白種類。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法評價

各牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳圖譜如圖1所示,五種牛乳的主要蛋白組分中,α-La、β-Lg和κ-CN純度較高,呈現(xiàn)單一主峰;而α-CN主要包含三個組分αs2-CN、αs1-CN及αs0-CN,根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品說明書及三種蛋白的性質(zhì)分析,確定遷移時間15.6 min的成分為αs2-CN、遷移時間16.8 min的成分為αs1-CN,遷移時間17.5 min的成分為αs0-CN;β-CN主要包含三個組分β-CN B、βA1-CN和βA2-CN,根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品說明書及三種蛋白的性質(zhì)分析,確定遷移時間18.5 min的成分為β-CN、遷移時間19.3 min的成分為βA1-CN,遷移時間20.3 min的成分為βA2-CN。隨后,原料乳的檢測也能夠清晰分辨以上9個主要的蛋白組分(圖1)。

圖1 牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與原料乳的電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of bovineprotein standards and raw milk注:1:α-La;2:β-Lg;3:αs2-CN;4:αs1-CN;5:αs0-CN;6:κ-CN;7:β-CN B;8:β A1-CN;9:β A2-CN,圖2同。

將不同濃度的乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品建立特征峰面積與濃度間的回歸方程,并進(jìn)行重現(xiàn)性和回收率實驗,結(jié)果見表1。五種牛乳中主要蛋白組分的相對遷移時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,加標(biāo)回收率均在88%～102%之間,表明方法的精密度和準(zhǔn)確度較好。

表1 各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及對應(yīng)的重復(fù)性和回收率Table 1 The regression equation,correlation coefficient,linear range,repeatability and recovery of each protein standard

2.2 不同SSC原料乳的蛋白組成分析

2.2.1 不同SSC數(shù)量的原料乳的毛細(xì)管電泳分析 采集得到的不同SSC數(shù)量的原料乳的毛細(xì)管電泳譜圖見圖2。從圖2中可以看出,隨著SSC數(shù)量的增加,1～9號樣品峰的大小有不同程度的變化,尤其是β-CN(7號峰)和βA1-CN(8號峰)出現(xiàn)了顯著的下降;而且隨著SCC的提升,也有新電泳峰的出現(xiàn),主要集中在3個遷移時間,分別為10～12 min(組分A)、15～16 min(組分B)和23～27 min(組分C),這些組分可能是由SSC所攜帶的plasmin等蛋白酶的水解作用生成[11]。

圖2 不同體細(xì)胞數(shù)原料乳樣品的電泳圖Fig.2 Electrophoregrams of raw milk with different somatic cell count

2.2.2 不同SSC數(shù)量的原料乳總蛋白含量變化 不同SSC的原料乳中總蛋白含量變化如圖3所示,分別用Foss乳成分及體細(xì)胞分析儀和毛細(xì)管區(qū)帶電泳譜圖中的峰面積來表征。常用的Foss乳成分及體細(xì)胞分析儀測定得到的總蛋白含量結(jié)果表明,不同SSC的原料乳間總蛋白含量并無顯著變化(p>0.05)。然而,用本文建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法的結(jié)果表明,乳中總蛋白含量隨著SSC的增加有上升趨勢,當(dāng)SSC增加到100萬個/mL以上時,開始有顯著性差異(p<0.05),這一結(jié)果與Santos等[1]的報道一致。

圖3 不同體細(xì)胞數(shù)的原料乳中總蛋白含量Fig.3 Total protein contents of raw milk with different somatic cell count

2.2.3 不同SSC數(shù)量的原料乳蛋白組成變化 不同SSC的原料乳的毛細(xì)管電泳譜圖中各特征峰對應(yīng)的峰面積變化如表2所示。結(jié)合表2可知,隨著體細(xì)胞數(shù)的增加,β-CN B和βA1-CN兩種蛋白的相對含量顯著降低(p<0.05);α-La、αs2-CN和βA2-CN的相對含量沒有顯著性變化(p>0.05);β-Lg、αs1-CN、αs0-CN、κ-CN的相對含量顯著增加(p<0.05)。

表2 電泳圖中各組分峰占總峰面積的比例Table 2 The peak area proportions of each component in electrophoregrams

2.2.4 不同SSC數(shù)量的原料乳乳清蛋白和酪蛋白的比例的變化 乳清蛋白和酪蛋白的比例是決定原料乳加工方式的重要依據(jù)。根據(jù)圖2中各個蛋白組分的含量結(jié)果,分析了不同SCC數(shù)量的原料乳中乳清蛋白和酪蛋白的變化規(guī)律,結(jié)果如表3所示。隨著SSC的增加,主要乳清蛋白的含量呈上升趨勢,這與已有研究結(jié)果一致[3]。同時,酪蛋白占總蛋白的比例隨牛乳體細(xì)胞數(shù)的增加顯著降低,這是因為在高體細(xì)胞數(shù)牛乳中存在相應(yīng)的蛋白水解酶,能將酪蛋白水解[1]。酪蛋白的水解及乳清蛋白的增加導(dǎo)致總酪蛋白與乳清蛋白的比例逐漸降低(表3),這一比值的改變不僅影響乳蛋白的結(jié)構(gòu),還會影響乳制品的宏觀物性如酸奶的凝膠質(zhì)量等。研究指出,隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的升高,酸奶凝膠的硬度和黏度均有所降低,酸奶的顆粒變粗糙。相同固形物含量的酸奶,隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的降低,酸奶的硬度和持水力均有所增加[12]。

表3 主要乳清蛋白和總酪蛋白占總蛋白的比例Table 3 The proportions of the main whey protein and casein

3 結(jié)論

本文利用毛細(xì)管電泳法測定了不同SSC的原料乳的蛋白組成及含量,結(jié)果表明:當(dāng)SSC增加到100萬個/mL以上時,總蛋白的含量才會顯著增加(p<0.05),但不同體細(xì)胞數(shù)的原料乳中,蛋白組分及含量均不同。隨著SSC的增加,α-乳白蛋白、αs2-酪蛋白和βA2-酪蛋白的含量無顯著差異(p>0.05),β-CN B和βA1-CN兩種蛋白的相對含量顯著降低(p<0.05),β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白、αs0-酪蛋白、κ-酪蛋白含量均顯著增加(p<0.05)。鑒于蛋白質(zhì)種類及含量的變化均會引起后續(xù)加工環(huán)節(jié)的品質(zhì)差異,本文建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法可以作為牛乳蛋白品質(zhì)測定的一種快速、可靠的檢測方法,為后續(xù)加工環(huán)節(jié)的原料選擇提供依據(jù)。

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