乳苣不同溶劑提取物對α-淀粉酶的抑制作用及光譜研究

高義霞,陶超楠,鄭 婷,朱玉芳,周向軍，*

(1.天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅天水 741001;2.甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心,甘肅天水 741001)

α-淀粉酶是一種隨機(jī)水解α-1,4糖苷鍵的Ca2+依賴性內(nèi)切淀粉酶,其催化淀粉轉(zhuǎn)化生成少量葡萄糖和糊精,已廣泛用于食品、化工等行業(yè)中。目前,國內(nèi)外有關(guān)α-淀粉酶的研究,主要集中在其高產(chǎn)菌篩選和鑒定、基因重組、表達(dá)及其抑制劑等方面[1-6]。α-淀粉酶抑制劑是一種糖苷酶抑制劑,可有效抑制消化道內(nèi)淀粉酶活性,阻止食物糖類的水解和吸收,降低人體血糖含量,抑制脂肪合成,臨床上常用于糖尿病、肥胖癥、高血糖和高血脂等疾病預(yù)防[7-8]。

乳苣(MulgediumtataricumL.)，又名蒙山萵苣、紫花山萵苣及苦菜等,為菊科乳苣屬藥食兩用草本植物。乳苣全草可藥用,主要化學(xué)成分為倍半萜和三萜類化合物[9],具有抗菌、抗癌及消炎等作用[10-12]。山楂葉、白蕓豆等活性成分對α-淀粉酶具有一定抑制作用[13-14],但有關(guān)乳苣中α-淀粉酶抑制劑的研究還未見報(bào)道。研究不同溶劑乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制作用、動(dòng)力學(xué)及作用機(jī)制等,不僅有助于從不同角度探討酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,且為尋找天然、安全降糖藥物提供重要的科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以乳苣全草為材料,α-淀粉酶為研究對象,研究水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶的抑制作用、類型、動(dòng)力學(xué)參數(shù)、紫外光譜和表面疏水性等影響,旨在為糖尿病、肥胖癥和高血脂等疾病預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

乳苣(MulgediumtataricumL.) 甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣農(nóng)田和水渠邊,經(jīng)鑒定為菊科乳苣屬乳苣。乳苣全草,室溫風(fēng)干,粉碎,過80目篩備用；α-淀粉酶(58.7 U/mg)、8-苯胺-1-萘磺酸(>97%純度) Sigma產(chǎn)品;可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉和亞硫酸氫鈉 國產(chǎn)分析純；3,5-二硝基水楊酸(DNS) 甲液:6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液,蒸餾水稀釋至69 mL,再加入6.9 g亞硫酸氫鈉；乙液:225 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液,再加入880 mL 1% 3,5-二硝基水楊酸溶液，混合甲乙溶液,棕色瓶放置一周后使用；0.05 mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液:七水合磷酸氫二鈉3.35 g,二水合磷酸二氫鈉1.95 g,450 mL蒸餾水溶解,調(diào)pH6.8,蒸餾水定容至500 mL。

UV1800型紫外可見分光光度計(jì)、RF-5301PC型熒光分光光度計(jì) 日本島津;AL204精密分析天平 瑞士梅特勒;電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;雷磁PHS-3D型pH計(jì) 上海精密科學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1α-淀粉酶反應(yīng)進(jìn)程曲線制作 采用Bernfeld法[15],稍作修改。取11.4 mL 0.05 mol/L pH6.8磷酸緩沖液于50 mL三角瓶中,加入0.6 mL 0.5 mg/mLα-淀粉酶液,充分混勻,50 ℃水浴20 min。加入3.0 mL 1%可溶性淀粉(預(yù)先經(jīng)50 ℃水浴)作為底物,混勻計(jì)時(shí)。酶促進(jìn)程曲線制作：前5 min每隔30 s,后5 min每隔1 min,取0.5 mL酶解液沸水滅活3 min,加入DNS試劑1.0 mL,沸水5 min,加水補(bǔ)至5.0 mL后540 nm測吸光值,制作酶促進(jìn)程曲線,確定線性時(shí)間。

1.2.2 乳苣提取物制備及其對α-淀粉酶的抑制作用 乳苣的水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物制備參考高義霞等方法[16]。取0.05 mol/L pH6.8磷酸緩沖液3.8 mL,加入0.5 mg/mLα-淀粉酶0.2 mL,混勻后加入各提取物(水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物)，使其終濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL,充分混勻,50 ℃水浴20 min,加入50 ℃預(yù)熱的1%可溶性淀粉溶液1.0 mL,1.5 min后沸水滅活,加入DNS試劑1 mL,沸水5 min,室溫中冷卻后,蒸餾水定補(bǔ)至5.0 mL,520 nm處測吸光值。以0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液代替酶液,作為空白對照。α-淀粉酶抑制率(%)=(A0-A1)/A0×100。式中:A0為未添加提取物吸光值,A1為添加提取物吸光值。

1.2.3 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制類型和動(dòng)力學(xué)參數(shù) 取1%可溶性淀粉1.0 mL,分別測定0.0、0.5、2.0、4.0 mg/mL各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)時(shí),α-淀粉酶活性隨其濃度變化趨勢,以酶含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),判斷不同提取物對α-淀粉酶的抑制類型。固定α-淀粉酶濃度為0.02 mg/mL,測定可溶性淀粉濃度分別為0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL時(shí),水和石油醚提取物對應(yīng)的Ki,可溶性淀粉濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg/mL時(shí),正丁醇提取物對應(yīng)的Kis或Ki[17-18]。

1.2.4 乳苣提取物對α-淀粉酶紫外和表面疏水性的影響 固定α-淀粉酶濃度為0.5 mg/mL,測定各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分別為0.0000、0.0125、0.0250、0.0375和0.0500 mg/mL時(shí),作用10 min后其對α-淀粉酶紫外光譜的影響,同時(shí)作對照實(shí)驗(yàn);固定ANS為8.0 mmol/L,α-淀粉酶濃度為0.5 mg/mL,各提取物(水、正丁醇和石油醚提取物)分別為0.00、0.25、0.50和1.00 mg/mL,作用10 min。在激發(fā)波長344 nm,400～600 nm掃描,測定其對α-淀粉酶表面疏水性影響,同時(shí)作對照實(shí)驗(yàn)[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS 16.0中Profit分析方法計(jì)算半抑制濃度IC50,利用Origin 7.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線

酶活力測定,首先需確定線性反應(yīng)時(shí)間,線性時(shí)間應(yīng)在初速度范圍內(nèi)選擇,而初速度對應(yīng)的時(shí)間范圍需通過酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線來選擇。進(jìn)程曲線常以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物增加量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系曲線表示。

反應(yīng)起始階段,曲線斜率幾乎不變,但隨時(shí)間延長,曲線平緩,速率降低,可能原因是底物濃度降低、產(chǎn)物濃度增加引起的逆反應(yīng)加強(qiáng)、產(chǎn)物對酶抑制或酶本身部分失活等[20]。酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線見圖1。吸光值隨時(shí)間延長幾乎成線性增加,隨后逐漸趨于平緩,產(chǎn)物增加量減慢。1.5 min內(nèi)線性較好,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上,時(shí)間延長則線性降低,不利于后續(xù)數(shù)據(jù)擬合。因此,酶活測定時(shí)間選擇1.5 min。

圖1 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.1 Enzymatic reaction curve

2.2 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制作用

由圖2可知,在0～8.0 mg/mL范圍內(nèi),水、正丁醇和石油醚提取物對α-淀粉酶抑制作用均隨其濃度增大而增強(qiáng)(p<0.05)。當(dāng)提取物濃度大于2.0 mg/mL時(shí),水、正丁醇和石油醚提取物抑制率均超過50%,大于8.0 mg/mL時(shí),石油醚提取物抑制率接近100%。在0～2.0 mg/mL范圍內(nèi),隨氯仿提取物濃度增加,其對α-淀粉酶的抑制作用出現(xiàn)波動(dòng),在2.0～8.0 mg/mL范圍內(nèi),氯仿提取物對α-淀粉酶抑制作用逐漸增強(qiáng)(p<0.05);在0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶幾乎無抑制作用,當(dāng)大于6.0 mg/mL時(shí),抑制作用急劇增強(qiáng)(p<0.05);利用SPSS 16.0軟件中的Profit分析方法,其中,響應(yīng)頻率為抑制率,協(xié)變量為抑制劑濃度[21],求得水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶IC50分別為2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇抑制作用較穩(wěn)定且較強(qiáng)的水、正丁醇和石油醚提取物。

圖2 不同乳苣提取物對α-淀粉酶抑制作用Fig.2 Inhibition effects of Mulgedium tataricum L.extracts on α-amylase

2.3 乳苣提取物對α-淀粉酶的抑制類型和動(dòng)力學(xué)特征

圖3、圖5和圖7中,C為各溶劑提取物濃度。在底物濃度和水/正丁醇提取物濃度不變條件下,體系吸光值隨α-淀粉酶含量增加呈線性增加。不同水/正丁醇提取物濃度條件下,各直線幾乎相交于原點(diǎn),且直線斜率隨提取物濃度增加而下降,表明水/正丁醇提取物對α-淀粉酶的抑制作用,不是通過降低有效酶量導(dǎo)致活力下降的,而是通過抑制酶活性導(dǎo)致催化效率降低,表現(xiàn)為可逆抑制作用[22];石油醚提取物對α-淀粉酶抑制作用則與此不同,以吸光值對酶含量作圖,為一組平行直線,見圖7。隨石油醚提取物濃度不斷增大,直線平行從原點(diǎn)向右移動(dòng),說明石油醚提取物在反應(yīng)初期對酶為不可逆抑制,使酶永久失活,從而減少有效酶量。因此,石油醚提取物與α-淀粉酶間存在一定化學(xué)計(jì)量數(shù)的抑制關(guān)系,僅當(dāng)酶的物質(zhì)的量大于石油醚提取物時(shí),即有過量酶分子時(shí),才表現(xiàn)出活力。此時(shí),不同抑制劑濃度條件下的反應(yīng)初速度,隨酶量增加表現(xiàn)為與對照組一樣,為相互平行的直線[23]。但對照組未通過原點(diǎn),可能是該體系中存在某些未知α-淀粉酶激活因素或某些激活因素占優(yōu)。

圖3 水提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.3 Inhibition type of water extract on-amylase

圖5 正丁醇提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.5 Inhibition type of butanol extracts on α-amylase

圖7 石油醚提取物對α-淀粉酶抑制類型Fig.7 Inhibition type of petroleum ether extracts on α-amylase

圖4中,以1/V對1/S作圖,V為反應(yīng)速度,S為底物濃度。雙倒數(shù)作圖得到一組橫軸截距不變的直線,水提取物不影響米氏常數(shù)(Km),只影響最大反應(yīng)速度(Vmax),抑制類型為非競爭性抑制。這表明水提取物與α-淀粉酶活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合,且這種結(jié)合并不影響酶與底物結(jié)合,同時(shí),底物與酶的結(jié)合,也不影響酶與水提取物的結(jié)合,兩者相互獨(dú)立。但由于酶-底物-水提取物不能進(jìn)一步形成產(chǎn)物,所以不能通過增加底物濃度來降低其對酶的抑制程度[24]。以雙倒數(shù)作圖各斜率對水提取物濃度作圖,求得Ki為1.653 mg/mL。

圖4 水提物的1/V-1/S曲線Fig.4 1/V-1/S curve of water extraction

由圖6可知,雙倒數(shù)作圖得到一組斜率不同,并交于第三象限的直線,抑制類型為線性混合抑制類型,即兼具反競爭性和非競爭性抑制。線性混合抑制作用類似于非競爭性抑制作用,酶可首先與底物或抑制劑結(jié)合,酶與底物結(jié)合不影響其與抑制劑進(jìn)一步結(jié)合,反之,酶與抑制劑結(jié)合也不影響其與底物進(jìn)一步結(jié)合。但線性混合型抑制中,酶與底物或抑制劑結(jié)合次序不同,則具有不同的反應(yīng)常數(shù)[25]。以雙倒數(shù)作圖各斜率和截距分別對正丁醇提取物濃度作圖,求得Ki和Kis分別為0.795和0.435 mg/mL,前者約為后者1.828倍,表明正丁醇提取物與酶-底物絡(luò)合物的親和力強(qiáng)于其與游離酶親和力[26]。當(dāng)?shù)孜餄舛群驼〈继崛∥锞鶠?.0 mg/mL時(shí),α-淀粉酶活性幾乎被完全抑制,故圖6未設(shè)置此組實(shí)驗(yàn)。

圖6 正丁醇提取物的1/V-1/S曲線Fig.6 1/V-1/S curve of butanol

由圖8可知,雙倒數(shù)作圖得到一組斜率不同,并幾乎交于Y軸的直線,為競爭性抑制。這表明石油醚提取物可能與底物具有某些結(jié)構(gòu)相似性,與底物共同競爭酶活性中心結(jié)合位點(diǎn),不能與酶-底物絡(luò)合物結(jié)合,主要通過誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使酶催化活性降低[27],屬于底物型不可逆抑制,亦即鄒承魯教授提出的競爭性不可逆抑制[28-29],求得Ki為2.893 mg/mL。

圖8 石油醚提取物的1/V-1/S曲線Fig.8 1/V-1/S of petroleum ether extracts

2.4 乳苣提取物對α-淀粉酶紫外光譜的影響

α-淀粉酶最大吸收波長在280 nm附近,主要由色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)側(cè)鏈的光吸收引起,其波長或吸收強(qiáng)度變化可反映Trp和Tyr殘基所處微環(huán)境的改變,故可選擇紫外吸收光譜探討α-淀粉酶結(jié)構(gòu)變化。由圖9～圖11可知,未加α-淀粉酶時(shí),0.05 mg/mL的水、正丁醇和石油醚提取物在280 nm均無特征吸收峰。當(dāng)水、正丁醇和石油醚提取物濃度增大時(shí),α-淀粉酶紫外吸收均逐漸增強(qiáng),表明上述提取物與α-淀粉酶相互作用后,改變了Trp和Tyr等芳香族殘基的微環(huán)境,從而引起α-淀粉酶吸收強(qiáng)度改變[30]。但α-淀粉酶紫外光譜均無明顯紅移或藍(lán)移現(xiàn)象,這說明各提取物與α-淀粉酶相互作用,僅通過氫鍵、范德華力、離子鍵和疏水相互作用等非共價(jià)作用,輕微改變其空間構(gòu)象,并不發(fā)生共價(jià)作用。

圖9 水提取物紫外光譜Fig.9 Ultraviolet spectrum of water extract

圖10 正丁醇提取物紫外光譜Fig.10 Ultraviolet spectrum of n-butyl alcohol extract

圖11 石油醚提取物紫外光譜Fig.11 Ultraviolet spectrum of petroleum ether extract

2.5 乳苣提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性與其來源、加工方法、加工條件和溶劑有關(guān),也與其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)[31]。熒光探針ANS單獨(dú)存在時(shí),最大發(fā)射波長在510 nm附近,熒光強(qiáng)度極小。水提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響見圖12。由圖12可知,當(dāng)水提取物處理時(shí),ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至470 nm附近。隨水提取物濃度增大,ANS熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),表明適宜濃度水提取物處理,可增強(qiáng)酶分子表面更多疏水區(qū)域暴露,誘發(fā)了α-淀粉酶的解折疊[32],從而可結(jié)合更多的ANS陰離子使熒光強(qiáng)度增強(qiáng);正丁醇提取物對α-淀粉酶表面疏水性影響見圖13。由圖13可知,當(dāng)正丁醇提取物處理時(shí),ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至450 nm附近。當(dāng)正丁醇提取物較低(0.25 mg/mL)時(shí),增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度,這可能是低濃度正丁醇提取物與ANS結(jié)合,使酶分子部分伸展,導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面更多疏水區(qū)域暴露,從而可結(jié)合更多ANS陰離子;但當(dāng)正丁醇提取物濃度較高(0.5～1.0 mg/mL)時(shí),正丁醇提取物與ANS陰離子同時(shí)競爭結(jié)合酶分子表面,因而導(dǎo)致與ANS陰離子結(jié)合減弱,熒光強(qiáng)度下降[33];石油醚提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響見圖14。由圖14可知,當(dāng)石油醚提取物處理時(shí),ANS最大發(fā)射波長由510 nm遷移至490～500 nm附近。與正丁醇提取物不同,當(dāng)?shù)蜐舛?0.25 mg/mL)石油醚提取物處理時(shí),其可能鑲嵌于酶分子的疏水性空穴中,并通過靜電相互作用部分穩(wěn)定了酶分子的空間結(jié)構(gòu),相當(dāng)于阻止了疏水基團(tuán)暴露,因而降低了熒光強(qiáng)度。當(dāng)高濃度(0.5～1.0 mg/mL)石油醚提取物處理時(shí),其主要作用是使酶分子的空間結(jié)構(gòu)完全伸展,疏水基團(tuán)最大化暴露,因而增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度。各提取物的熒光強(qiáng)度并未隨溶劑極性增大而降低,即未遵循“正溶劑動(dòng)力學(xué)”效應(yīng)[34],原因是不同溶劑提取物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同,其對α-淀粉酶和ANS熒光強(qiáng)度的影響葉不同。另外,水提取物熒光強(qiáng)度明顯高于正丁醇和石油醚提取物,原因是水是質(zhì)子性溶劑,ANS與其形成氫鍵能力較強(qiáng),相當(dāng)于在ANS周圍形成了有序的簇集體系[35],有效保護(hù)了ANS熒光發(fā)射。正丁醇雖為質(zhì)子性溶劑,但質(zhì)子供體能力遠(yuǎn)低于水分子,石油醚為非質(zhì)子性溶劑,因此兩者較為接近,且遠(yuǎn)低于水提取物熒光強(qiáng)度。

圖12 水提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.12 Effects of water extract on surface hydrophobicity of α-amylase

圖13 正丁醇提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.13 Effects of n-butyl alcohol extract on surface hydrophobicity of α-amylase

圖14 石油醚提取物對α-淀粉酶表面疏水性的影響Fig.14 Effects of petroleum ether extract on surface hydrophobicity of α-amylase

3 結(jié)論與討論

水、正丁醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯對α-淀粉酶的IC50分別為2.002、4.086、1.248、4.299和6.904 mg/mL,其中,石油醚提取物對α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)。由于在0～2.0 mg/mL范圍內(nèi),氯仿提取物對α-淀粉酶的抑制作用出現(xiàn)波動(dòng),且氯仿毒性較大;在0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶幾乎無抑制作用,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)未考慮氯仿和乙酸乙酯提取物。由上述分析可見,乳苣的水、正丁醇和石油醚提取物是一種潛在有效的α-淀粉酶抑制劑,可通過分離純化進(jìn)一步篩選其單體,以用于糖尿病、肥胖癥等疾病預(yù)防。另外,水、正丁醇、石油醚提取物均可增加α-淀粉酶的紫外吸收強(qiáng)度,但不改變其吸收峰位置,這主要是3種提取物均可改變α-淀粉酶空間構(gòu)象,使芳香族氨基酸而分布在酶分子表面,從而增強(qiáng)了紫外吸收能力,但未發(fā)生共價(jià)相互作用,不破壞酶分子的一級結(jié)構(gòu);水、正丁醇、石油醚提取物均可使ANS發(fā)生藍(lán)移,改變了其熒光發(fā)射峰位置。

本實(shí)驗(yàn)中,乳苣不同溶劑提取物對α-淀粉酶的抑制類型與其它植物提取物不完全一致。水提取物對α-淀粉酶為可逆非競爭性抑制;正丁醇提取物對α-淀粉酶為可逆混合性抑制,屬于反競爭性和非競爭性混合抑制,類似于非競爭性抑制作用。該類混合抑制的特點(diǎn)是雙倒數(shù)曲線相較于第三象限,ES+IEIS的平衡常數(shù)小于Kis;石油醚提取物對α-淀粉酶為不可逆競爭性抑制,屬于底物型不可逆抑制,亦即鄒承魯教授提出的競爭性不可逆抑制。劉華[27]研究表明,大黃酸對α-淀粉酶是一種可逆競爭性抑制劑,并與對照阿卡波糖進(jìn)行了對比。另外,隨大黃酸濃度增加,大黃酸誘導(dǎo)α-淀粉酶空間構(gòu)象變得更加精密而不利于活性中心形成。劉自琴[36]研究表明,紅茶和綠茶浸提液對豬α-淀粉酶均為可逆非競爭性抑制,且該相互作用過程中,α-淀粉酶紫外吸收強(qiáng)度增加,綠茶浸提液使吸收峰發(fā)生紅移。這說明,不同的植物種類或溶劑提取物,對不同的酶具有不同的抑制類型,主要取決于提取物有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

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