雜交蘭 ‘黃金小神童’ 四倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究

李 涵 李慧敏 陸 琳 楊少杰 瞿素萍 田 敏 黎 霞 曹 樺

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650100；2. 云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650100)

雜交蘭 ‘黃金小神童’ (CymbidiumGolden Elf ‘Sundust’) 是大花蕙蘭 (Cymbidiumhybridum) 與四季蘭素心 (Cymbidiumensifoliumvar.rubrigemmum‘Suxin’) 的雜交種[1-2]，花型較大、香氣雅致、鮮艷奪目、純正黃色，因而又被稱為 “黃花素心”[2]。黃金小神童四季都可開花，可控制花期，滿足人們的喜好，既可賞花又能聞香[1,3]，具有重要的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，市場前景可觀。近年來，多倍體育種在植物新品種選育中應(yīng)用廣泛，推動了植物的進(jìn)化[4]。多倍體染色體數(shù)目加倍，個體外形表現(xiàn)巨大性，色澤鮮艷，細(xì)胞內(nèi)含物增加[5-6]；表現(xiàn)出耐輻射、耐紫外光、抗性較強(qiáng)[7-8]，花型巨大、花色艷麗等特征，這對觀花植物來說具有十分重要的研究價值。

目前，蘭花多采用秋水仙素進(jìn)行化學(xué)誘變，在大花蕙蘭[9]、石斛 (Dendrobiumnobile)[10]、蝴蝶蘭 (Phalaenopsisaphrodite)[11]、黃嬋蘭 (Cymbidiumiridioides)[12]多倍體誘導(dǎo)上獲得成功。但作為化學(xué)誘變劑，秋水仙素存在誘導(dǎo)率低、毒性大等缺點(diǎn)，對人和環(huán)境具有很大危害。安磺靈是一種新型的除草劑，具有與植物蛋白親和力高、與動物蛋白親和力低的特點(diǎn)，因此誘導(dǎo)植物多倍體效率高、環(huán)境污染小[13-15]。甲基黃酸乙酯 (EMS) 是一種常用的化學(xué)誘變劑，具有操作簡單、突變頻率高、突變專一性與多效性等優(yōu)點(diǎn)[16]。目前，運(yùn)用各種化學(xué)誘變劑育種的報道較多見，但運(yùn)用2種或2種以上化學(xué)誘變劑的鮮見報道。本研究通過EMS和安磺靈2種誘變劑組合使用，目的在于提高雜交蘭誘變率、快速獲得穩(wěn)定性好的四倍體株系以降低多倍體育種成本，為雜交蘭多倍體育種研究提供理論數(shù)據(jù)，期望能選育出觀賞價值高、抗性好的雜交蘭新品種；同時，為化學(xué)誘變在誘變劑使用上提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所基地內(nèi)選取市場流行品種雜交蘭 ‘黃金小神童’ 莖尖為外植體材料，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + EMS 20～70 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 瓊脂7 g/L，pH值為5.4～5.8條件下，誘導(dǎo)獲得根狀莖；在分化培養(yǎng)基MS + 6-BA 5 mg/L + NAA 1 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 花寶1號2.5 g/L + 花寶2號0.6 g/L + 花寶5號0.8 g/L + 瓊脂7 g/L中，經(jīng)pH值5.4～5.8分化得組培苗。建立成熟組培快繁體系。組培苗經(jīng)過鑒定，根尖染色體數(shù)目為2n=2x=40，為二倍體植株。無菌條件下，取1 cm長的健壯根狀莖作為誘導(dǎo)多倍體的基礎(chǔ)材料。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度 (25 ± 1) ℃，相對濕度70%～80%，光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx，光照12 h/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多倍體誘導(dǎo)

以安磺靈和EMS作為誘導(dǎo)劑，采用復(fù)合化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)的方法，對雜交蘭根狀莖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計，按不同比例配比2種誘導(dǎo)劑，對 ‘黃金小神童’ 根狀莖進(jìn)行誘導(dǎo)。無菌條件下，取根狀莖中斷，生長健壯的1 cm根狀莖，用濃度為0、0.001%、0.002%、0.003%對其進(jìn)行浸泡，處理時間分別為24、48、72 h，后用滅菌蒸餾水清洗3次，滅菌濾紙吸干水分。后接種到含有不同EMS濃度 (0、20、50、70 mg/L) 的無菌固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS + EMS 20～70 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 瓊脂7 g/L，pH值為5.4～5.8，進(jìn)行無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，1個月后，統(tǒng)計死亡率。后把存活根狀莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS + 6-BA 5 mg/L + NAA 1 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 花寶1號2.5 g/L + 花寶2號0.6 g/L + 花寶5號0.8 g/L + 瓊脂7 g/L中，pH值為5.4～5.8進(jìn)行培養(yǎng)；60 d后根狀莖形成組培苗，長出幼嫩根，初步觀察其形態(tài)變化，統(tǒng)計變異率。

1.2.2變異植株形態(tài)鑒定

處理過后的根狀莖，經(jīng)過分化成苗，部分植株會呈現(xiàn)粗壯、葉色濃綠、葉片寬大肥厚、葉片卷曲的形態(tài)特征。把具有這些形態(tài)特征的植株初步判定為多倍體植株，進(jìn)行初步的篩選和變異率的統(tǒng)計，隨機(jī)選取二倍體單株和變異單株各30株，測量葉長、葉寬、葉厚、株高、莖粗。

1.2.3變異植株氣孔鑒定

選擇天氣晴朗的上午8:00—11:00，氣孔持張開狀態(tài)，隨機(jī)選取雜交蘭二倍體植株材料和變異植株材料同一部位的新鮮葉片各30片，用鑷子輕輕撕取葉片中部的下表皮，置于載玻片上，制作臨時玻片。40倍光學(xué)顯微鏡隨機(jī)測量氣孔10個，微尺測量氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的長和寬，檢測10個不同的視野，求其平均值。

1.2.4多倍體染色體鑒定

采用F-BSG法在9:00—12:00，細(xì)胞分裂旺盛時期，取變異植株的幼嫩根尖1～1.5 cm裝入離心管中，分別對植株和根尖編號。用質(zhì)量濃度為0.1%的秋水仙素浸泡4 h后，清洗，卡諾固定液 (V(無水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1) 固定20～24 h后，清洗，然后用濃度為1 mol/L的鹽酸在60 ℃下解離8～10 min，清洗，把根尖放在載玻片中央，滴2～3滴卡寶品紅染色液，染色3～5 min，從染液的一角輕輕蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片，用新鉛筆有橡皮頭的一端輕敲蓋玻片，使根尖均勻分散。用Nika顯微鏡 (Eclipse E800) 鏡檢拍照，跟據(jù)染色體數(shù)確定其倍數(shù)。

1.2.5多倍體的穩(wěn)定

經(jīng)3種方法鑒定篩選的變異植株，接種到MS + 6-BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 瓊脂7 g/L培養(yǎng)基中，并在溫度 (25 ± 1) ℃、光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx、光照12 h/d的條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)長出根狀莖，重新進(jìn)行切割，經(jīng)誘導(dǎo)、分化成苗、生根后取根尖染色體鑒定，同一變異植株經(jīng)過3次分離穩(wěn)定及鑒定，染色體數(shù)目穩(wěn)定一致，確定變異植株為四倍體，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 安磺靈和EMS復(fù)合誘導(dǎo)雜交蘭根狀莖的誘導(dǎo)效果

以植株外部形態(tài)變異和氣孔顯著增大為初步鑒定指標(biāo)。死亡標(biāo)準(zhǔn)是指養(yǎng)1個月后仍不能發(fā)育，以后根狀莖逐漸死亡。由表1可知，雜交蘭根狀莖以安磺靈濃度為0.002%處理48 h，EMS濃度為50 mg/L加入培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月的變異效果最佳，變異率為52%，死亡率僅為6%。隨著安磺靈和EMS濃度的增加，死亡率有所增加，但差別不顯著，最高死亡率為10%。

表1 安磺靈和EMS不同濃度和處理時間對雜交蘭根狀莖的誘導(dǎo)效果Table 1 The induction effects of different concentrations and treatment time of oryzalin and EMS on Cymbidium rhizome

0.001%～0.003%安磺靈處理24～72 h后均有不同程度的變異植株出現(xiàn)，變異率為16%～44%。根狀莖不經(jīng)過安磺靈浸泡直接接入含有EMS 0～70 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)變異率較低，變異率為0～4%。2種誘變劑配合使用變異效果顯著。

2.2 多倍體植株的鑒定

2.2.1外部形態(tài)鑒定結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn)雜交蘭根狀莖經(jīng)過處理培養(yǎng)1月后 (圖1)，與對照根狀莖相比，生長速度較緩慢，分化出的根狀莖更粗狀，表面突起較明顯，伴輕微玻璃化。將誘導(dǎo)處理過的根狀莖分化培養(yǎng)形成植株，部分植株生長緩慢，株型緊湊矮狀，葉片增厚，葉脈較深，葉色深綠，部分葉片扭曲，葉尖分叉。對照植株葉片光滑、質(zhì)薄、葉色淺。誘導(dǎo)后的根狀莖和分化的植株與對照植株的在外部形態(tài)上有明顯區(qū)別，多倍體葉長和株高指標(biāo)相對二倍體降低2.79%和2.92%，差異不顯著；多倍體葉寬、葉厚和莖粗指標(biāo)與二倍體相比增加31.74%、39.28%和37.85%，差異極顯著，見表2。

圖1多倍體與二倍體根狀莖和株型比較
Fig.1 Comparison of rhizome and strain between polyploid and diploid

表2 多倍體與二倍體植株外部形態(tài)的比較Table 2 Comparison of external morphology between polyploid and diploid strain

2.2.2氣孔鑒定結(jié)果

選擇正常植株與多倍體植株各4～6片全展葉，取相同部位的葉片下表皮在顯微鏡下觀察氣孔，測量氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的長寬，見表3。由表3可知，雜交蘭多倍體植株葉片氣孔形態(tài)特征與二倍體的基本相似，但氣孔大小差異顯著；多倍體植株葉片單位面積的氣孔數(shù)較二倍體少，氣孔增大。多倍體氣孔長和寬、保衛(wèi)細(xì)胞長和寬分別比二倍體增加了28.45%和30.27%、28.10%和34.08%，氣孔密度比二倍體降低了38.23%。

表3 多倍體與二倍體氣孔大小的比較Table 3 Comparison of the stomatal size between polyploid and diploid

2.2.3染色體鑒定結(jié)果

將外部形態(tài)鑒定和氣孔鑒定后的變異植株進(jìn)行生根，采用根尖壓片法鑒定其染色體數(shù)目，見圖2。二倍體材料細(xì)胞染色體數(shù)為2n=2x=40，誘導(dǎo)處理后的變異植株染色體數(shù)目增多，且根尖細(xì)胞體積明顯增大。其中，大量細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=4x=80，還出現(xiàn)40～120條染色體數(shù)目不等的情況，這可能是植株染色體小、染色體重疊、莖尖細(xì)胞核粘稠、細(xì)胞出現(xiàn)嵌合體等原因。

對安磺靈濃度為0.002%處理48 h，EMS濃度為50 mg/L加入培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行變異植株的初步篩選，得到40%的四倍體 (2n=4x=80)，再進(jìn)行繼代培養(yǎng)增殖后進(jìn)行染色體鑒定，變異的根尖細(xì)胞中四倍體的比例為80%。再次把篩選出來的四倍體進(jìn)行繼代培養(yǎng)增殖后進(jìn)行鑒定，得到四倍體比例為90%。

圖2雜交蘭二倍體和四倍體染色體
Fig.2 Chromosome of diploid and tetraploidCymbidium

3 結(jié)論與討論

安磺靈和EMS作為高效的化學(xué)誘變劑，逐漸被諸多學(xué)者運(yùn)用到不同的植物誘變研究中，然而，這2種高效誘變劑組合誘變的研究卻未見報道。本實(shí)驗(yàn)采用安磺靈浸泡處理結(jié)合EMS混培法對雜交蘭 “黃金小神童” 進(jìn)行誘導(dǎo)，在所有實(shí)驗(yàn)組中，根狀莖的最高死亡率僅為10%，說明安磺靈和EMS對根狀莖傷害程度較小。其中，又以0.002%安磺靈浸泡48 h，并接種到含有50 mg/L EMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月的實(shí)驗(yàn)組，根狀莖的誘變率最高，達(dá)52%，死亡率僅為6%，且含高達(dá)40%的四倍體。繼代培養(yǎng)后，四倍體比重呈梯度上升。綜合各實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，相比單一誘變法，組合誘變法的誘變率顯著提高，死亡率顯著降低。誘變得到的雜交蘭多倍體組培苗材料顯現(xiàn)出多倍體的性狀，即生長緩慢，植株矮小粗壯，葉片顏色變深增厚等。因此選擇安磺靈和EMS組合誘變具有高效性、獨(dú)創(chuàng)性和科學(xué)性，可將本實(shí)驗(yàn)方法推廣至其他蘭花或植物品種的四倍體研究中。

自然界中高等植物四倍體的發(fā)生機(jī)率極低，一般采用秋水仙素等誘變劑進(jìn)行單一誘變，然而，誘變率低、毒性大等因素大大地限制了四倍體在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中，上述氨磺靈及EMS組合誘變四倍體的方法是非常高效且環(huán)保的新方法，也為下一步新品種的選育及繼續(xù)創(chuàng)造提供了依據(jù)。

在雜交蘭誘導(dǎo)領(lǐng)域中，使用秋水仙素等化學(xué)誘變劑對植物組織和細(xì)胞有較強(qiáng)的毒害作用，且使用時濃度難以控制[17]；王愛華等[18]以秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛2n花粉得到6.22%的誘導(dǎo)率，王木桂等利用秋水仙素對墨蘭進(jìn)行誘導(dǎo)得最高誘變率19.44%[19]，季碧霞等[20]在對大花蕙蘭多倍體的研究中，用秋水仙素對其進(jìn)行誘導(dǎo)，最高誘導(dǎo)率為28.2%，最低死亡率為7.3%；李雪嬌等[21]對云南野生碧玉蘭的研究中，以秋水仙素誘導(dǎo)其無菌試管苗，最低死亡率為30%；石從廣等[22]利用EMS對甘藍(lán)型油菜進(jìn)行誘變時得8.46%的誘變率；而本實(shí)驗(yàn)中氨磺靈與EMS組合使用所得到的最高誘變率達(dá)52%，最低死亡率為6%。因此，相對于單一誘變劑來說，氨磺靈與EMS組合誘變的方法具有絕對的高效性和安全性。

本實(shí)驗(yàn)中所獲得的四倍體材料將直接進(jìn)行移栽煉苗，測量多倍體移栽成活率。成活后進(jìn)行田間定期觀察并測試性狀的變化，同時對四倍體性狀是否穩(wěn)定進(jìn)行比測。植株開花后，觀察花朵的性狀，希望能夠篩選出優(yōu)良的多倍體新品種，為蘭花種質(zhì)資源創(chuàng)新提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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