專性菌系對(duì)石油烴污染土壤的修復(fù)性能

王麗萍,李 丹,許銳偉,吳雪茜 (中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測(cè)繪學(xué)院,江蘇 徐州 221116)

在石油開采、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏、加工、利用過程中,不合理的作業(yè)方式或意外事故導(dǎo)致大量石油進(jìn)入土壤環(huán)境,發(fā)生一系列物理、化學(xué)、生化反應(yīng),造成嚴(yán)重的土壤石油污染.生物修復(fù)技術(shù)由于其環(huán)境友好性、經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)逐漸成為當(dāng)代修復(fù)石油污染土壤的重要手段之一,具有較大潛力[1-2].

已有研究表明, 單一菌種通常只能降解特定組份的單一石油烴,多組分的石油烴降解需要多種微生物參與,保證反應(yīng)的逐步進(jìn)行.由于石油烴的復(fù)雜性,專性菌系誘導(dǎo)生物降解比單一菌更有效,它能夠適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件,可以實(shí)現(xiàn)石油烴的高效降解[3-4].具有高活性、持久性和兼容性專性菌的選育一直是研究重點(diǎn).

影響專性菌系降解石油烴效果的環(huán)境因素有營養(yǎng)元素,溫度,pH 值,石油烴的難溶性和土壤的強(qiáng)吸附作用等[5].十二烷基硫酸鈉(SDS),直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS),脂肪醇聚氧乙烯醚(Brij 30),聚山梨酯-80(吐溫 80)和生物表面活性劑對(duì)生物降解石油烴的影響表明,以上表面活性劑均能顯著提高石油烴的溶解度,大大增強(qiáng)其在土壤中的生物可得性[6-7].近來有學(xué)者采用微生物-表面活性劑復(fù)合技術(shù)來修復(fù)污染土壤并取得了良好的效果,但不同類型表面活性劑對(duì)專性菌系降解石油烴的影響機(jī)制需要進(jìn)行進(jìn)一步研究探索.因此,選擇合適的表面活性劑來增強(qiáng)專性菌系對(duì)石油烴的降解效果是有必要的.

本研究將生物強(qiáng)化與表面活性劑結(jié)合起來,采用液相“中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式得到穩(wěn)定、健全的具有高效降解能力的專性菌系,并篩選適合模擬石油污染土壤的表面活性劑,以達(dá)到提高污染土壤中石油烴降解率的目的.隨后進(jìn)行土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步評(píng)估最佳環(huán)境條件下專性菌系對(duì)石油污染土壤修復(fù)性能,從而為實(shí)際土壤修復(fù)提供可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 石油烴由徐州市中國石化集團(tuán)管道儲(chǔ)運(yùn)公司提供.活性污泥采自徐州華裕煤氣有限公司焦化廢水處理廠的污泥濃縮池.本研究中使用的未受污染的頂層土壤取自中國礦業(yè)大學(xué)校園東南角(117°9′10″E,34°13′4″N)的砂土.從土壤表面10～20cm處取樣,將采集的土樣密封在聚乙烯袋中.風(fēng)干 5d,將大塊土壤破碎研磨并用60目篩篩分以除去大顆粒和碎屑.將50g石油烴溶于5mL甲醇,并加入到1kg土壤中,然后再次風(fēng)化攪拌均勻.將土壤儲(chǔ)存在玻璃罐中老化 50d.總石油烴(TPH)的濃度和配置土壤的物理化學(xué)性質(zhì)如表1所示.

表1 配置土壤的物理化學(xué)性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of composite soil

1.1.2 無機(jī)鹽營養(yǎng)液 無機(jī)營養(yǎng)液為污泥馴化時(shí)所用,每升活性污泥中添加 2.0g NH4Cl、2.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、1.0g MgSO4·7H2O;120mg FeCl3、50mg H3BO3、10mg CuSO4·5H2O、10mg KI、45mg MnSO4·H2O、20mg NaMoO4·2H2O、75mg ZnCl2·4H2O 、 50mg CoCl2·6H2O、 20mg AlK(SO4)2·12H2O 、 13mg CaC12·2H2O 、 10mg NaCl.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種馴化與鑒定 專性菌系的馴化采用液相“中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式[8].用生理鹽水稀釋高溫滅菌后的活性污泥配置懸浮液,為了去除活性污泥中的營養(yǎng)元素,需要在塑料桶中曝氣 48h.然后進(jìn)入液相馴化階段,每日加入一定量無機(jī)營養(yǎng)液,并在濃度50～2000mg/L范圍內(nèi)用梯度遞增的方法投加底物.馴化方案如圖1所示.30d后,菌液密度穩(wěn)定在1.2g/L左右,表明馴化過程結(jié)束.取馴化第30d菌懸液中的菌群作為試驗(yàn)用菌群.

針對(duì)馴化前和馴化后樣品,分別取細(xì)菌培養(yǎng)液5mL,采用TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行DNA快速提取.通過紫外分光亮度計(jì)測(cè)定 DNA濃度和純度(OD260/OD280和OD260/OD230).利用洗脫緩沖液TE將DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增.樣品保存于-20℃冰箱中待用.

圖1 石油烴專性菌系的馴化實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 Domestication schedule of petroleum hydrocarbon specific bacteria

DNA保存菌株的 16SrDNA序列分析參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行.對(duì)16SrDNA的雙V區(qū)(V3-V4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用細(xì)胞引物 338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)及806R(5-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3),測(cè)序 V3V4區(qū).高通量測(cè)序工作由派森諾生物公司完成,所用測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq.相關(guān)序列已提交給GenBank,序列號(hào)為SRP083938.

1.2.2 石油烴的測(cè)定 純水和水土體系中的石油烴含量用紅外分光光度法測(cè)定,操作步驟參考HJ 637-2012[10].樣品中石油烴的濃度 C(mg/L)與石油烴降解率(%)的計(jì)算方法見式(1)～式(2).

式中:C為樣品中石油烴的濃度,mg/L;X、Y、Z、F為校正系數(shù);A2930, A2960, A3030為各對(duì)應(yīng)波數(shù)下測(cè)得的萃取液吸光度;V0為萃取液溶劑的體積,mL;VW為樣品體積,mL;D為萃取液稀釋倍數(shù);C0為污染土壤中石油烴初始濃度,mg/L; Ct為t時(shí)刻石油烴濃度,mg/L.

1.2.3 最適溫度和pH值的確定 在250mL錐形瓶中加入 100mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基,并加入 9mL菌液使保持菌液密度在 0.1g/L,并加入 10g人工配置的污染土.(1)調(diào)節(jié)pH值為中性,溫度分別設(shè)置為 10,20,30,35,40℃;(2)溫度設(shè)置為 30℃,用稀HCl與0.6%的NaOH溶液將pH值 分別調(diào)節(jié)為5,6,7,8,9;轉(zhuǎn)速 180r/min,置于搖床振蕩培養(yǎng)6,12,18,24,48,72h后,分別測(cè)定石油烴降解率.每組設(shè)立 3個(gè)平行樣,每天補(bǔ)充試驗(yàn)過程中蒸發(fā)的去離子水.

1.2.4 臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定 室溫(25℃)條件下,水土比為10:1時(shí),采用JYW-200A全自動(dòng)液體界面張力測(cè)試儀測(cè)定不同濃度吐溫 80及SDS的表面張力,繪制表面張力與表面活性劑濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線,根據(jù)圖中的拐點(diǎn),計(jì)算出CMC值:吐溫80的CMC為75mg/L, SDS的CMC為2500mg/L.

1.2.5 吐溫80和 SDS對(duì)專性菌系降解石油烴的影響 將10g滅菌的土壤加入100mL去離子水中,加入9mL菌液保持菌液密度在0.1g/L左右.接種后分別加入 0.25,0.5,1,2和 5CMC吐溫 80和 SDS.然后將溶液置于搖床中振蕩培養(yǎng)(25℃,180rpm)72h.使用傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀(Thermo iS5,Nicolet Instrument Corporation,USA)進(jìn)行水土體系中的石油烴濃度分析.

1.2.6 表面活性劑-專性菌系體系修復(fù)石油污染土壤模擬試驗(yàn) 本課題組前期研究確定,最適合本修復(fù)試驗(yàn)的條件為 C:N:P=100:4:0.67.在木質(zhì)容器中進(jìn)行石油烴污染土壤修復(fù)試驗(yàn),設(shè)置 3個(gè)試驗(yàn)組:未接種專性菌系、未投加吐溫80(對(duì)照組 S0),接種專性菌系同時(shí)投加吐溫 80(S1),只接種降解菌、未投加吐溫 80(S2).每個(gè)試驗(yàn)組加入1kg石油烴污染土壤,石油烴初始濃度為 5%(w/w),菌液接種量為 10%(v/w).試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行,pH值為7～8.每5d加一次營養(yǎng)液.定時(shí)補(bǔ)充水分,使其含水量保證在 30%～40%,每周翻轉(zhuǎn)一次土壤以確保整個(gè)試驗(yàn)過程中氧含量充足.通過FTIR光譜儀定期測(cè)定石油烴濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴高效專性菌系的馴化與鑒定

將焦化廢水處理廠的活性污泥作為菌源,利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定菌群結(jié)構(gòu).共發(fā)現(xiàn)了 278個(gè)OTU(操作分類單元),顯示出菌落的生物多樣性.如表2所示,Alphaproteobacteria和gammaproteobacteria占主導(dǎo)地位,其含量分別為 32%和 46%.這與前人的研究相符, Alphaproteobacteria和gammaproteobacteria通常廣泛存在于長期被石油烴污染的環(huán)境中[11].進(jìn)一步分析這兩類菌的屬種水平,其中,Rhodanobacter sp.是優(yōu)勢(shì)菌種,占比 34%.Al-Jawasim等研究證實(shí),Rhodanobacter是石油烴污染土壤中的主要菌種.此外,土壤中檢測(cè)出大量的Mycobacterium sp.和 Rhizobium sp.,分別占比12%和 11%.兩種菌都能夠?qū)⑹蜔N作為碳源[12-13].單一優(yōu)勢(shì)降解菌降解單組分有機(jī)污染物取得較好的效果,通常被引入到反應(yīng)器中強(qiáng)化生態(tài)系統(tǒng)的凈化性能和穩(wěn)定性[14].但土壤中的有機(jī)污染物通常存在多組分共存時(shí)的相互抑制致使單一優(yōu)勢(shì)菌種難以同時(shí)將其去除的問題.另一方面,將單一專性菌直接引入到混合菌種,存在微生物適應(yīng)性差,生長緩慢,或與土著菌競(jìng)爭(zhēng)失利的問題.本試驗(yàn)中,活性污泥存在能夠降解石油烴的專性菌系,由于長期暴露于污染環(huán)境中的土著微生物將進(jìn)行自然選擇,因此通過活性污泥來馴化降解石油烴的專性菌系是合理的[15].這證實(shí)了把活性污泥作為菌源, 采用液相“中間產(chǎn)物-目標(biāo)污染物”專性降解菌的雙底物馴化方式以獲得用于土壤修復(fù)的穩(wěn)定、健全的專性菌系的可行性.

表2 石油烴專性降解菌的分布Table 2 Identification of dominant bacteria capable of degrading petroleum hydrocarbons

2.2 石油烴專性菌系生長環(huán)境的優(yōu)化

2.2.1 最佳溫度的確定 適宜的溫度是專性菌系降解土壤石油烴的重要條件.溫度主要通過影響石油烴的物性和微生物自身活性來影響降解過程[16].如圖2所示,專性菌系在10～40℃范圍內(nèi)對(duì)石油烴均有一定的降解能力,其中當(dāng)溫度為30～40℃時(shí),處理72h后石油烴的降解率大于30%.較低溫度(10～20℃)下的降解率顯著低于較高溫度(30～40℃)時(shí)的降解率.較低溫度導(dǎo)致微生物酶活性的降低,進(jìn)而抑制了微生物的生長,此外,低溫使石油烴黏度增大,難以被微生物充分利用,這導(dǎo)致石油烴降解率不高.Aislabie[17]等報(bào)道,升溫會(huì)增加碳?xì)浠衔镂廴疚锏娜芙舛?使長鏈烷烴從固相轉(zhuǎn)移到水相并降低其黏度,提高了微生物對(duì)石油烴的利用率,有助于石油烴降解率的升高.處理72h后, 30℃時(shí)降解率達(dá)到42%,此時(shí)降解率最高.當(dāng)溫度高于 30℃,石油烴降解率隨溫度的升高呈下降趨勢(shì), 40℃時(shí)降解率下降至 33%,這可能是隨著溫度的升高,微生物的生長受到抑制從而影響其代謝過程.可以推測(cè), 降解率在溫度為 30～35℃時(shí)最高,因此,專性菌系群降解石油烴的最適降解溫度為30～35℃.

圖2 不同溫度下石油烴降解率隨時(shí)間的變化Fig.2 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency under different temperatures

2.2.2 最佳pH值的確定 關(guān)于pH值對(duì)專性菌系降解石油烴的影響如圖3所示.pH值為7時(shí),石油烴的降解率最高(44%),pH值為9時(shí),甚至低于 30%.pH值在 5～7范圍內(nèi)變化時(shí),石油烴的降解率隨pH值升高逐漸增大. pH值大于7,石油烴降解率隨pH值的升高而減小.pH值為9時(shí), 石油烴降解率最低.這是由于 pH值除了與微生物的生命活動(dòng)有關(guān)外,還能對(duì)環(huán)境中有機(jī)物(如營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)污染物)的離子化程度產(chǎn)生影響,進(jìn)而間接影響微生物對(duì)石油烴的降解過程. 酸性條件下,H+會(huì)影響微生物膜的結(jié)構(gòu),因此,pH 值越低,微生物的膜結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定[18].堿性條件下,過多的 OH-會(huì)引起細(xì)胞膜上的電荷變化,阻礙細(xì)胞膜對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸過程[19].此外,由于微生物對(duì)污染物的降解依賴于其產(chǎn)生的活性物質(zhì)(酶),過多的OH-和H+均會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響,阻礙其正常代謝過程.因此,本研究菌群的最適 pH值為 7～8,專性菌系群適宜在中性以及偏微堿的土壤環(huán)境中生長.

圖3 不同初始pH值下石油烴降解率隨時(shí)間的變化Fig.3 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency under different pH

2.2.3 最佳表面活性劑及其最適濃度的確定圖4(a)顯示,當(dāng)吐溫80濃度低于或等于CMC(即0.25,0.5,1CMC)時(shí),吐溫 80會(huì)抑制水土體系中石油烴的降解,高于 CMC(即 2.5,5CMC)時(shí)可以促進(jìn)石油烴的降解.當(dāng)吐溫80的濃度為5CMC時(shí),石油烴的降解效率最高,為43%.這表示濃度大于CMC的吐溫80可以促進(jìn)石油烴降解,較高濃度的吐溫80具有更好的石油烴降解性能.如圖4(b)所示,水土體系中石油烴的降解效率受SDS濃度的影響.當(dāng) SDS濃度為 2CMC時(shí),石油烴降解效率最高,72h后達(dá)到31%.當(dāng)SDS的濃度低于或高于 2CMC時(shí),會(huì)抑制土壤石油烴的降解.當(dāng)吐溫80和 SDS濃度為 5CMC(325mg/L)和 2CMC(5000mg/L)時(shí),72h后石油烴降解效率最高(分別為42%和31%).結(jié)果表明,與添加SDS相比,添加吐溫 80后石油烴的降解效率更高,同時(shí)吐溫 80的投加量較少.因此,后續(xù)修復(fù)試驗(yàn)選擇濃度為5CMC(375mg/L)的吐溫80.

進(jìn)一步探討吐溫80和SDS在石油烴降解過程中的作用機(jī)制.當(dāng)吐溫80的濃度低于CMC(即0.25,0.5CMC)時(shí),石油烴的降解效率甚至低于對(duì)照組.由于濃度低于CMC的吐溫80不存在增溶作用,所以上述結(jié)果可能是由于吐溫80與石油烴之間存在碳源競(jìng)爭(zhēng)作用.前期研究表明,吐溫 80可以作為專性菌系生長的碳源.這進(jìn)一步證實(shí),低濃度的吐溫80引起的碳源競(jìng)爭(zhēng)作用會(huì)對(duì)石油烴的降解效果產(chǎn)生不利影響.當(dāng)吐溫80的濃度超過CMC(即2,5CMC)時(shí),除了吐溫80和石油烴之間的碳源競(jìng)爭(zhēng)作用之外,水土體系中還存在增溶作用.增溶作用可促進(jìn)石油烴降解,而碳源競(jìng)爭(zhēng)作用會(huì)抑制石油烴降解.在這種情況下,石油烴降解效率明顯提高,遠(yuǎn)高于對(duì)照組.這表明增溶作用引起的促進(jìn)作用比碳源競(jìng)爭(zhēng)作用引起的抑制作用更為顯著.與吐溫80不同的是,當(dāng)SDS的濃度超過0.25CMC 時(shí),會(huì)抑制專性菌系的生長.因此,當(dāng)SDS濃度低于 CMC(即 0.25,0.5CMC)時(shí),由于微生物抑制作用和碳源競(jìng)爭(zhēng)作用等負(fù)面影響,石油烴的降解效率甚至低于對(duì)照組.當(dāng)SDS濃度高于CMC時(shí),增溶作用開始出現(xiàn).當(dāng) SDS濃度為2CMC 時(shí),石油烴的降解效率最高.這表明,這種情況下增溶作用在石油烴降解過程中起主要作用.當(dāng) SDS濃度進(jìn)一步增加時(shí),微生物抑制作用隨之增強(qiáng).這表明由微生物抑制作用和碳源競(jìng)爭(zhēng)作用對(duì)石油烴降解效果造成的負(fù)面影響超過了溶解作用帶來的正面影響.盡管SDS可以提高石油烴的溶解度,但SDS的微生物抑制作用將導(dǎo)致降解石油烴的專性菌系失去降解功能.因此,石油烴降解效率降低,甚至低于對(duì)照組.綜上,石油烴在降解過程中受碳源競(jìng)爭(zhēng)作用,表面活性劑增溶作用和微生物抑制作用的相互影響,這可能與表面活性劑的用量有關(guān).

圖4 水土體系中吐溫80、SDS濃度對(duì)石油烴降解率的影響Fig.4 Effects of concentrations of Tween 80and SDS on petroleum hydrocarbon degradation in water-soil system

2.3 吐溫 80-專性菌系聯(lián)合技術(shù)修復(fù)石油污染土壤試驗(yàn)

進(jìn)一步進(jìn)行土壤修復(fù)試驗(yàn),以評(píng)估采用吐溫80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的可行性.圖5為修復(fù)過程中石油烴的降解率隨時(shí)間的變化.對(duì)于S0組(即未處理的土壤),僅有5.4%的石油烴被降解,這可能是由于其中的短鏈烴物質(zhì)具有揮發(fā)性且易被氧化.在整個(gè)修復(fù)試驗(yàn)中,S1組(只接種專性菌系)的降解效率(49%)顯著高于S0組,表明專性菌系能夠迅速適應(yīng)石油污染的新環(huán)境,并表現(xiàn)出較高的石油烴降解能力.與S0和S1組相比,S2組(接種專性菌系同時(shí)投加吐溫 80)降解效率(77%)明顯提高.如上所述,吐溫 80在提高石油烴的溶解度方面發(fā)揮了重要作用,從而提高了石油烴對(duì)專性菌系的生物可得性.S2組石油烴較高的降解率可能是由于微生物的快速增殖.修復(fù)試驗(yàn)前40d,S1,S2組降解效率相較于S0提高得更快.這是由于適應(yīng)期中,污染土壤中碳源供應(yīng)充足,微生物可以降解石油烴中的短鏈或直鏈烯烴.第 40d到第 80d,降解效率曲線趨于平緩,可能的原因如下:(1)易降解的石油烴已經(jīng)被專性菌系完全消耗[20];(2)可能產(chǎn)生并積累了有毒中間代謝物或副產(chǎn)物[21];(3)隨著碳源的消耗,專性菌系的活性明顯降低.土壤修復(fù)試驗(yàn) 80d后在自然光中可以清晰看到 S0組污染土壤的樣品仍為黑色塊狀.S2組土壤顏色呈黃色,質(zhì)地疏松.在 S1和 S2組土壤樣品中未觀察到油污結(jié)塊土.進(jìn)一步表明,這些樣品的石油烴污染程度得到有效的緩解.

與S0組相比,S1組的結(jié)果表明,馴化后的專性菌系可以有效降解石油烴,從而證實(shí)了采用活性污泥作為菌源以獲得土壤修復(fù)專性菌系的可行性.與S1組相比,S2組的結(jié)果表明,加入吐溫80可以提高石油烴的降解率.上述試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),短期內(nèi),石油烴降解效率的提高主要來自吐溫80的增溶作用.與S0和S1組相比,S2組的結(jié)果表明,吐溫 80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)在石油烴污染土壤修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用前景.

圖5 80d修復(fù)過程中石油烴降解率隨時(shí)間變化Fig.5 Time-dependent changes of petroleum hydrocarbon degradation efficiency during 80days' bioremediation time

3 結(jié)論

3.1 采用“鄰苯二酚-石油烴”雙底物馴化模式,得到了石油烴的專性降解菌系,經(jīng)高通量測(cè)序可知,馴化后的專性降解菌系以產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter sp.)為主,占比 41.0%.專性菌系具有生物降解石油烴的性能,培養(yǎng)80d后,石油烴降解率可達(dá)49%.

3.2 溫度為 30～35℃,pH 值為 7～8 時(shí),專性菌系對(duì)土壤石油烴的降解效果最好.

3.3 吐溫 80對(duì)石油烴降解的促進(jìn)作用優(yōu)于SDS.當(dāng)吐溫 80的濃度為 5CMC(即 375mg/L)時(shí)石油烴的降解效率最高,可達(dá)42%.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)吐溫80在石油烴降解過程中增溶作用占主導(dǎo)作用,而不是碳源競(jìng)爭(zhēng)作用.3.4 最優(yōu)條件下,同時(shí)接種專性菌系并投加吐溫80d后石油烴降解率高達(dá)77%,比僅接種專性菌系或僅投加吐溫80時(shí)石油烴的降解效率更高,證實(shí)利用吐溫 80-專性菌系聯(lián)合修復(fù)技術(shù)進(jìn)行石油烴污染土壤修復(fù)的可行性.

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