奎寧功能化的混合模式有機-硅膠雜化整體柱的制備和應用

劉 凱， 鄭 娜， 林旭聰， 呂海霞

(1. 福州大學材料科學與工程學院， 福建 福州 350116； 2. 福州大學化學學院， 福建 福州 350116)

0 引言

毛細管電色譜(CEC)是一種結(jié)合毛細管電泳(CE)和液相色譜(LC)雙重分離性能的微分離技術(shù)， 是當前微分離分析技術(shù)的熱點. 毛細管色譜柱是CEC的核心. 在色譜柱中毛細管整體柱由于制備簡單， 通透性良好， 可實現(xiàn)快速分離， 具有較高的相比和柱容量[1-2].

在整體柱中有機-硅膠雜化整體柱在無機硅膠整體柱的基礎(chǔ)上， 結(jié)合有機聚合整體柱的優(yōu)點， 具有較好的機械穩(wěn)定性、 抗溶脹性和耐酸堿性以及具有較大的比表面積等優(yōu)點[3-5]， 得到分離領(lǐng)域的廣泛關(guān)注. 隨著功能化單體的發(fā)展， 發(fā)展新型功能化雜化整體柱在近年來備受關(guān)注， 比如混合模式整體柱.

混合模式色譜是指一根色譜柱上能夠?qū)崿F(xiàn)兩種或多種分離機理共同主導的分離技術(shù)[6-8]， 利用固定相多種作用力對物質(zhì)進行保留、 分離， 具有更好的選擇性和分離效率. 近年來， 在含氯的硅膠整體柱上通過親核反應衍生含氮雜環(huán)的化合物， 為制備混合模式雜化整體柱提供新的方向[9]， 反應生成的季銨型陽離子， 不僅可以提供陰離子作用位點， 還可以有效地削減整體柱上殘留的硅羥基所造成的不利影響. Wang等[10]以4, 4′-聯(lián)吡啶作為功能單體， 在氯丙基硅膠雜化整體柱上通過柱后衍生， 制備混合模式的雜化整體柱， 該整體柱具有親水作用、 π-π作用、 陰離子交換作用以及氫鍵作用， 并且成功應用于CEC對苯酚類、 核苷酸類、 生物堿類等多類物質(zhì)的分離. 目前氯丙基整體柱與含氮雜環(huán)的化合物主要集中在含吡啶類和咪唑類離子液型化合物， 在喹啉類化合物還未見報道.

通過柱后衍生， 將奎寧修飾到氯丙基硅膠基質(zhì)柱上， 制備出新型的混合模式有機-硅膠雜化整體柱. 奎寧功能化的雜化硅膠整體柱具有明顯的反相作用、 π-π作用和陰離子交換作用. 在CEC模式下， 整體柱對模版分子、 多環(huán)芳烴、 有機酸類物質(zhì)以及堿性的煙堿類物質(zhì)實現(xiàn)高效分離.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器： 毛細管電色譜儀(2 100 GV， Unimicro， USA)； 電子掃描顯微鏡(XL30ESEM， FEI， USA).

試劑： 四甲氧基硅烷(TMOS)、 氯丙基三甲氧基硅烷(CPTMS)、 尿素(Urea)和奎寧(Acros, New Jersey, USA)； 聚乙二醇(PEG， 10 000 M.W.， Aldrich, Milwaukee, WI, USA)； 醋酸(色譜純， 天津福辰試劑)； 對羥基苯甲酸、 苯甲酸、 肉桂酸(Milwaukee, WI, USA)； 甲苯、 硫脲、 N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、 磷酸、 鹽酸、 氫氧化鈉、 三乙胺(分析純， 上海試劑總廠)； 萘、 芴、 菲、 芘(阿拉丁)； 尼古丁氧化物 (NC-1-oxide)、 可替寧(COT)、 3-羥基可替寧(3-OH-COT)、 可替寧氮氧化物(COT-N-oxide)、 降尼古丁(NNC)(98%， 中國藥品與生物制品檢定所)； 實驗用水為二次蒸餾水.

毛細管柱(75 μm ID×375 μm OD， 河北永年光導纖維廠).

1.2 毛細管整體柱的制備

圖1 奎寧功能化的雜化整體柱制備示意圖Fig.1 Scheme for the preparation quinine of functionalized hybrid monolithic column

1) CP-硅膠柱的制備. 首先將680 mg PEG和900 mg Urea溶解于5.0 mL 0.01 mol·L-1醋酸水溶中， 再將0.6 mL CPTMS和1.8 mL TMOS加入， 在冰浴條件下攪拌水解4 h. 形成透明均一的溶膠溶液后， 取1 mL水解液， 冰浴超聲3 min， 用微型注射器注入預處理好的毛細管中. 將毛細管兩端封閉， 置于55 ℃恒溫水浴鍋中反應12 h， 反應結(jié)束后用二次水和甲醇依次沖洗柱子， 除去未反應的制孔劑和其它殘留的物質(zhì)， 得到氯丙基功能化的雜化整體柱.

2) 奎寧衍生修飾CP-硅膠柱. 將含有40 mg·mL-1的奎寧和KI催化劑的甲醇/水(3∶1， 體積比)溶液通過液相色譜泵注入到已制備好的CP-硅膠整體柱中， 在80 ℃下反應12 h. 最后用二次水和甲醇依次清洗， 將柱床內(nèi)殘留的反應物洗出， 即得到奎寧修飾的CP-硅膠雜化整體柱. 反應原理如圖1所示.

1.3 色譜條件

實驗所用流動相為乙腈-磷酸三乙胺(TEAP)緩沖液. 流動相使用前用0.22 μm微膜過濾， 超聲脫氣. 實驗前整體柱用甲醇平衡30 min， 在電色譜儀器上施加電壓平衡至所獲得穩(wěn)定的電壓和基線信號. 柱溫保持室溫.

2 結(jié)果與討論

2.1 奎寧衍生條件優(yōu)化

由于奎寧分子結(jié)構(gòu)中的N原子與CP-硅膠柱固定相表面的氯丙基發(fā)生親核反應， 產(chǎn)生季銨型陽離子， 從而可以提供反向電滲流. 所以實驗通過分析奎寧功能化的雜化整體柱產(chǎn)生EOF的情況來優(yōu)化奎寧的反應濃度.

圖2 奎寧濃度對EOF的影響Fig.2 Effect of quinine concentration on EOF

在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1, pH=3.0)=45∶55(體積比)， 分離電壓為+20 kV的條件下， 實驗考察奎寧的濃度在10～50 mg·mL-1間EOF的變化， 如圖2所示. 奎寧功能化的雜化整體柱在酸性條件下產(chǎn)生反向電滲流， 說明奎寧成功衍生在氯丙基硅膠基質(zhì)柱上. 在10～40 mg·mL-1之間時， 隨著奎寧濃度的增大， 電滲流急劇增大， 當奎寧的濃度從40增加到50 mg·mL-1時， 曲線上升趨勢不明顯， EOF接近定值. 因此， 當奎寧在緩沖液中的濃度為40 mg·mL-1時， 整體柱具有明顯的電滲流， 所以40 mg·mL-1為奎寧的的衍生濃度.

2.2 整體柱特征分析

2.2.1 形態(tài)分析

利用掃描電鏡(SEM)對奎寧衍生制備的雜化整體柱的形貌特征進行觀察， 如圖3所示. 該雜化整體柱的固定相呈球團態(tài)， 固定相與毛細管內(nèi)壁緊密鍵合， 沒有脫壁現(xiàn)象； 柱床結(jié)構(gòu)均勻， 既有大孔徑的中孔， 又有微孔徑的通孔， 有利于分析物與雜化柱的相互作用.

圖3 奎寧功能化雜化整體柱的電鏡圖Fig.3 SEM images of quinine functionalized hybrid monolithic capillary columns

2.2.2 EOF

圖4 pH值對奎寧雜化整體柱和氯丙基硅膠柱EOF的影響Fig.4 Effect of pH on the EOF of hybrid monolithic column and quinine-silica monolithic column

由于季銨型陽離子的生成， 整體柱可以產(chǎn)生反向EOF； 奎寧分子上有殘留的硅羥基， 可以電離帶負電. 所以固定相表面凈電荷的密度決定EOF的大小. 在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1)=45∶55(體積比)， 分離電壓為+20 kV的條件下， 實驗研究流動相pH值對EOF大小的影響， 如圖4所示. 在較低的pH值(3.0～6.0)范圍內(nèi)， 隨著pH值的增大， EOF值逐漸減小， 這是因為奎寧分子上的硅羥基開始解離， 帶負電的硅羥基使固定相表面正電凈電荷減小， 導致整體柱的EOF減小. 繼續(xù)增大流動相的pH值， 奎寧分子大量解離的硅羥基， 抑制了N原子的質(zhì)子化， 致使EOF由陽極EOF轉(zhuǎn)變?yōu)殛帢OEOF. 這與文獻報道的在CP-硅膠基質(zhì)柱上修飾含氮雜環(huán)化合物產(chǎn)生EOF變化情況相似[11].

2.2.3 整體柱分離的重現(xiàn)性

實驗選用硫脲作為不保留物質(zhì)， 通過考察整體柱的EOF、 甲苯、 DMF、 甲酰胺的保留時間和柱效來評價整體柱的重現(xiàn)性. 實驗計算獲得整體柱的EOF， 結(jié)果顯示整體柱在日內(nèi)(n=5)、 日間(n=3)以及不同批次間的RSD≦3.0%， 保留時間和柱效RSD保持在4.6%(n=5或n=3)以內(nèi)， 這表明通過奎寧衍生制備的雜化整體柱重現(xiàn)性良好.

2.3 電色譜性能表征

2.3.1 極性小分子的分離

實驗首先選擇甲苯、 DMF和硫脲3種極性小分子來考察雜化整體柱的色譜保留作用. 3種分子的電色譜分離圖， 如圖5所示， 出峰順序為硫脲、 DMF、 甲苯. 在保證磷酸三乙胺為5 mmol·L-1, pH值為 3.0， 分離電壓+20 kV不變的條件下， 考察乙腈含量對模板分子保留的影響， 如圖6所示， 當流動相中ACN含量(體積分數(shù)， 下同)低于78%時， 極性最強的硫脲先出峰， 極性強的DMF次出峰， 極性稍弱的甲苯最后出峰， 根據(jù)極性從強到弱的方式， 與反相作用保留模式保持一致. 繼續(xù)增加ACN含量， 雜化柱對非極性物質(zhì)甲苯洗脫作用加強， 在78%～90%之間， 甲苯和DMF的出峰順序發(fā)生變化， 當ACN含量高于90%時， 出峰順序變?yōu)榧妆健?硫脲、 DMF， 說明奎寧修飾的雜化整體柱具有弱的親水作用.

圖5 3種極性小分子的電色譜分離圖Fig.5 Electromatoram of three small polar molecules

圖6 乙腈對極性小分子保留因子的影響Fig.6 Effect of ACN on the retention factors of small polar molecules

2.3.2 多環(huán)芳烴的分離

實驗考察所制備的整體柱對多環(huán)芳烴(PAHs)類化合物的分離能力. 實驗選用4種多環(huán)芳烴類物質(zhì)萘、 芴、 菲、 芘， 其不飽和度依次為7、 8、 10、 12， 如圖7所示， 4種物質(zhì)在奎寧功能化的雜化整體柱上實現(xiàn)了基線分離， 萘、 芴、 菲、 芘依次出峰， 按照四種物質(zhì)的不飽和度即π共軛體系增大的順序出峰， 因為奎寧分子中含有較強的π共軛結(jié)構(gòu)， 與4種多環(huán)芳烴產(chǎn)生π-π作用， 所以奎寧功能化的雜化整體柱與多環(huán)芳烴之間的保留作用基于π-π作用. 實驗在磷酸三乙胺為5 mmol·L-1, pH值為3.0， 分離電壓+20 kV不變的條件下， 考察乙腈含量對多環(huán)芳烴保留因子的影響， 如圖8所示， 乙腈含量在40%～60%之間， 隨著乙腈含量的增加， 4種多環(huán)芳烴的保留因子逐漸減小， 這是由于乙腈含量提高， 增強了對4種多環(huán)芳烴的洗脫， 反相作用減弱. 綜上， 表明固定相對多環(huán)芳烴的保留作用主要是π-π作用和反相作用. 圖7為乙腈含量50%時四種多環(huán)芳烴分離的色譜圖.

圖7 PAHs的電色譜分離圖Fig.7 Electrochromatogram of PAHs

圖8 乙腈含量對PAHs保留因子的影響Fig.8 Effect of ACN on the retention factors of PAHs

2.3.3 有機酸的分離

實驗考察了所制備的整體柱對苯甲酸類化合物(對羥基苯甲酸、 苯甲酸、 肉桂酸)的分離. 由于奎寧與氯丙基發(fā)生親核反應生成季銨型陽離子， 提供陰離子交換作用的位點， 在較低的酸性條件下， 該雜化柱主要提供反向電滲流. 因此實驗在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1)=45∶55(體積比)， 分離電壓為+20 kV的條件下， 通過改變pH值來考察3種苯甲酸類物的保留. 如圖9所示， 在pH值3.0～4.0范圍內(nèi)， 隨著pH值的增大， 3種有機酸的電離程度增強， 與雜化整體柱固定相之間的靜電吸附作用增強， 故有機酸保留作用增強. 繼續(xù)增大pH值， 苯甲酸和肉桂酸的保留因子開始減小， 這是因為隨著pH值的增大， 奎寧分子上的硅羥基解離使整體柱固定相表面所帶凈正電荷減小， 導致3種有機酸與固定相間的靜電吸附作用減弱. 這一結(jié)果與離子交換作用機理相一致[12].

2.3.4 煙堿類化合物的分離

在毛細管電色譜模式下， 利用無機硅膠柱或通過sol-gel法制備的有機-硅膠雜化整體柱對堿性化合物的分離時， 由于毛細管柱壁有殘留的硅羥基， 在分離時會產(chǎn)生非特異性吸附， 導致峰形拖尾， 分離效果不理想. 針對此類問題， 實驗選用5種煙堿類堿性化合物(尼古丁氧化物、 可替寧、 3-羥基可替寧、 可替寧氮氧化物、 降尼古丁)， 利用混合模式進行分離. 由于煙堿類化合物均帶有共軛的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)可與雜化柱產(chǎn)生疏水作用和π-π作用， 而且在酸性條件下電離帶正電， 煙堿類化合物可與雜化柱產(chǎn)生靜電作用. 結(jié)果如圖10所示， 在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1, pH=3.0)=40∶60(體積比)， 分離電壓為+15 kV的條件下， 5種煙堿類化合物在CEC模式下按照極性由強到弱的順序出峰， 實現(xiàn)了良好的分離， 峰形基本對稱， 沒有明顯的拖尾情況.

圖9 pH值對3種有機酸的保留因子影響Fig.9 Effect of pH on the retention factors of three organic acids

圖10 5種煙堿化合物的電色譜分離圖Fig.10 Electrochromatogram of five nicotinic compounds

3 結(jié)語

在氯丙基硅膠整體柱固定相表面， 通過親核反應衍生奎寧功能單體， 制備新型混合作用模式的有機-硅膠雜化整體柱. 該雜化整體柱結(jié)構(gòu)均勻， 而且由于奎寧功能單體的引入， 使得該雜化整體柱在低pH值條件下產(chǎn)生陽極EOF， 可以提供陰離子交換作用， 同時具有疏水作用和π-π作用. 極性小分子、 多環(huán)芳烴以及有機酸在雜化整體柱上得到基線分離， 并且在混合模式下實現(xiàn)了對煙堿類物質(zhì)的分離， 沒有明顯拖尾現(xiàn)象.

參考文獻：

[1] DULAY M, KULKARNI R, ZARE R. Preparation and characterization of monolithic porous capillary columns loaded with chromatographic particles[J]. Analytical Chemistry, 1998, 70(23): 5103-5107.

[2] GUIOCHON G. Monolithic columns in high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1168(1/2): 101-68.

[3] XU L, LEE H. Preparation, characterization and analytical application of a hybrid organic-inorganic silica-based monolith[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1195(1/2): 78-84.

[4] EL-SAFTY S. Organic-inorganic hybrid mesoporous monoliths for selective discrimination and sensitive removal of toxic mercury ions[J]. Journal of Materials Science, 2009, 44(24): 6764-6774.

[5] BAI L G, LIU H, LIU Y,etal. Preparation of a novel hybrid organic-inorganic monolith for the separation of lysozyme by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(1): 100-106.

[6] HAN H, LI J, WANG X,etal. Synthesis of ionic liquid-bonded organic-silica hybrid monolithic column for capillary electrochromatography[J]. Journal of Separation Science, 2011, 34(16/17): 2323-2328.

[7] 董雪芳, 蔡曉明, 沈愛金, 等. 混合模式色譜分離材料的研究及其應用進展[J]. 色譜, 2013, 31(4): 297-302.

[8] YANG Y, GENG X. Mixed-mode chromatography and its applications to biopolymers[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(49): 8813-8825.

[9] MANT C, HODGES R. Mixed-mode hydrophilic interaction/cation-exchange chromatography(HILIC/CEX) of peptides and proteins[J]. Journal of Separation Science, 2008, 31(15): 2754-2773.

[10] WANG X, ZHENG N, HUANG Y,etal. Dipyridyl-immobilized ionic liquid type hybrid silica monolith for hydrophilic interaction electrochromatography[J]. Electrophoresis, 2013, 34(20/21): 3091-3099.

[11] TANG S, WANG L, HAN H, et al. Preparation and characterization of dipyridine modified hybrid-silica monolithic column for mixed-mode capillary electrochromatography[J]. Rsc Advances, 2013, 3(21): 7894-7901.

[12] YE M, ZOU H, LIU Z,etal. Separation of acidic compounds by strong anion-exchange capillary electrochromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 887(1/2): 223-231.