添加紫薯提取物和酪蛋白水解物酸奶降血壓和護肝功能評價

胡志和，夏 磊，李艷軍，王麗娟，薛 璐

隨著生活節(jié)奏的加快和壓力的增大，我國心血管疾病和肝病的發(fā)病率明顯上升[1]。據(jù)資料顯示，在全球約10億 人患有高血壓癥狀，其中25 歲以上人群占40%左右[2]，而我國高血壓患者數(shù)量目前已超過2.7億[3]，占世界患者總數(shù)量1/4以上。對肝病而言，非酒精性脂肪性肝病在全世界的發(fā)病率高達17%～33%[4]；而全球每年因患酒精肝死亡的人數(shù)約250萬，在北美洲有1%的人群患有酒精肝，在我國過度飲酒成為引起肝臟損害的第二大病因[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，高血壓與肝病之間存在密切關(guān)系，根據(jù)鄭盛等[6]研究結(jié)果，原發(fā)性高血壓伴非酒精性脂肪性肝病患者體質(zhì)量指數(shù)、超重率、血清總膽固醇、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等指標(biāo)水平均顯著高于原發(fā)性高血壓不伴非酒精性脂肪性肝病的患者。另外，趙文革等[7]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝病患者中高血壓的患病率較高。趙宇等[8]通過對非原發(fā)性高血壓患者（41 例）和非酒精性脂肪性肝病伴原發(fā)性高血壓患者（62 例）相關(guān)指標(biāo)檢測，發(fā)現(xiàn)后者在體質(zhì)量指數(shù)、腰臀比值、空腹血糖、胰島素濃度、三酰甘油、高敏C反應(yīng)蛋白、胰島素抵抗指數(shù)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等指標(biāo)水平均高于前者，且存在顯著差異，進而得出結(jié)論，老年非酒精性脂肪性肝病是原發(fā)性高血壓的危險因素。

多年來，高血壓和肝病的治療多以藥物治療為主，但長期服用會產(chǎn)生一些副作用[9]。因此，開發(fā)具有輔助降血壓和護肝功能的食品，對高血壓和肝病的預(yù)防和輔助治療工作尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，紫薯花青素具有護肝[10-14]、抗高血壓[15-16]、抗高血糖[17-20]、抗氧化[21-24]、抗動脈粥樣硬化[22,25]、降血脂減肥[26]等功能。而通過酪蛋白水解產(chǎn)生的ACE抑制肽，具有抗高血壓和改善心臟功能[27-29]。

在功能食品開發(fā)方面，到目前為止，鮮見一種產(chǎn)品同時具有降高血壓和護肝功能。本研究以富含花青素的紫薯提取物（purple sweet potato extract，PSPE）和富含血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽的酪蛋白水解物為主要功能原料，在普通酸奶發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)具有輔助降壓和護肝功能的酸奶，利用實驗動物模型評價其降血壓和護肝功能，旨在通過功能食品的途徑輔助預(yù)防高血壓癥狀和保護肝臟。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性原發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）（SPF級）購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；正常雄性Wistar大鼠（SPF級）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

富含花青素的PSPE（PSPE-A）（花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.25%）、富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物（CH-A）（有效ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%） 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院食品工藝實驗室；MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；直投式發(fā)酵劑、全脂鮮牛乳 天津海河乳業(yè)有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、ALT、TG、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總蛋白定量測定試劑盒南京建成生物工程研究所；無水乙醇、10%福爾馬林、二甲苯 天津昊斯生物技術(shù)有限公司；多賴處理防脫片、伊紅染液、Harris蘇木素染液 北京中杉金橋公司；切片石蠟 上海懿洋儀器有限公司；組織包埋盒江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；FA40均質(zhì)機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；PB-10型pH計 德國賽多利斯股份公司；LS-50HJ高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BJ-1CD超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司；BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計 北京軟隆科技有限責(zé)任公司；SpectraMax 190型酶標(biāo)分析儀 深圳市山特科技有限公司；M165C體視顯微鏡 德國徠卡公司；YD-335電腦切片機、YD-A生物組織攤片機、YD-B生物組織烤片機 金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠；GOLD-SIM冷凍干燥機 金西盟北京儀器有限公司；Supcre G6R全自動菌落計數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 添加PSPE-A和CH-A酸奶的制備

1.3.1.1 酸奶的制備流程

全脂牛乳→加入蔗糖及其他原料→加入CH-A和PSPE-A→攪拌均勻→均質(zhì)→巴氏殺菌→冷卻→接種→保溫發(fā)酵（43 ℃）→冷藏后酵→成品

1.3.1.2 功能性成分添加量的確定

根據(jù)本實驗室前期研究[30]，選用CH-A與PSPE-A聯(lián)合添加，有效降血壓劑量為每千克SHR體質(zhì)量：10.0 mg CH-A+5.0 mg PSPE-A、10.0 mg CH-A+10.0 mg PSPE-A，添加上述功能性成分并發(fā)酵制備酸奶，按照每人（體質(zhì)量60 kg）喝200 g酸奶計算，制備的兩種酸奶中，1 kg酸奶中功能成分的添加量分別為：3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A、3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A。PSPE-A的制備參照文獻[30]，CH-A的制備參照文獻[31]。

1.3.1.3 CH-A和PSPE-A添加量對乳酸菌生長的影響

制作乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)曲線：無菌條件下，稱取0.01 g直投式乳酸菌菌種，用無菌生理鹽水20 mL溶解，振蕩5 min，使菌體充分分散。無菌條件下吸取一定量乳酸菌懸液，添加至滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。將活化后的菌液按體積分?jǐn)?shù)10%添加量于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。無菌條件下取二次活化后菌液，將菌液濃度調(diào)整為108CFU/mL左右，然后用無菌水分別稀釋1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 倍，振蕩搖勻并迅速測定600 nm波長處OD值；同時將稀釋液分別進行平板計數(shù)培養(yǎng)。計算菌落數(shù)，繪制乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。

添加CH-A和PSPE-A對乳酸菌生長的影響：取4 支三角瓶，分別添加100 mL的MRS液體培養(yǎng)基，滅菌（121 ℃、20 min）后迅速加入PSPE-A和CH-A，每升添加量分別為：0.0 g CH-A+0.0 g PSPE-A、3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A、3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A。充分振蕩混勻，冷卻至室溫，吸取10 mL上述培養(yǎng)基至滅菌的試管中（作為空白）。向剩余培養(yǎng)基中添加10 mL經(jīng)活化的菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 h測定菌液的OD值，測定波長為600 nm。

1.3.1.4 添加CH-A和PSPE-A對酸奶發(fā)酵的影響

在普通酸奶的配方（牛乳887 g、白砂糖85 g、其他物料28 g）中，按照1.3.1.2節(jié)的劑量添加CH-A和PSPE-A，并按照1.3.1.1節(jié)的工藝制備酸奶，發(fā)酵溫度43 ℃，發(fā)酵時間5.5 h，然后，在6 ℃環(huán)境下存放12 h。檢測相關(guān)指標(biāo)。

酸奶活菌數(shù)測定：分別稱取5 g酸奶放入三角瓶中，加入45 mL無菌生理鹽水稀釋，振蕩搖勻，制成1∶10（m/V）的稀釋樣液，再取1 mL稀釋液加9 mL無菌生理鹽水稀釋，作10 倍遞增稀釋，制成1∶100的稀釋液，以此類推。選擇105～107稀釋倍數(shù)進行厭氧平板培養(yǎng)，每個稀釋度作2 個平板。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，用全自動菌落計數(shù)儀測定菌落數(shù)。

酸奶酸度的測定：參照文獻[32]方法，結(jié)合pH計用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定100 mL酸奶至pH值為8.3（酚酞的變色點），所消耗NaOH溶液的體積即為酸奶的酸度。

凝固型酸奶黏度測定：NDJ-5S型黏度計測量黏度。

凝固型酸奶質(zhì)構(gòu)分析：選用A/BE探頭，壓力盤直徑35 mm。設(shè)定參數(shù)為：下降速率與測試速率為1.0 mm/s，提升速率為1.0 mm/s，測試深度300 mm，感應(yīng)力為Auto-5 g，記錄速率200 PPS。每個樣品重復(fù)測定2 次。

1.3.2 含有CH-A和PSPE-A酸奶降血壓效果評價

1.3.2.1 單次灌胃含有CH-A和PEPE-A的酸奶

雄性SHR 32 只，周齡為12 周，體質(zhì)量為（255±15）g。自由采食飲水，在（23±1）℃和相對濕度為（60±5）%的條件下預(yù)飼養(yǎng)1 周。然后隨機分為4 組，每組8 只。以3.33 g/kg劑量分別灌胃生理鹽水、普通酸奶（0 g CH-A+0 g PSPE-A）、1 kg酸奶中含有3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A的酸奶及含有3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A的酸奶。每天灌胃1 次，測定灌胃后1～8 h的尾動脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP），觀察灌胃后SHR每小時的SBP的變化。另取正常Wistar大鼠20 只，分為4 組，分別作為空白組（生理鹽水組）和3 個樣品組，灌胃劑量為3.33 g/kg。

1.3.2.2 每天兩次灌胃添加CH-A和PSPE-A的酸奶

12 周齡雄性SHR 16 只，體質(zhì)量為（260±15）g，自由采食飲水，在（23±1）℃和相對濕度為（60±5）%的條件下預(yù)飼養(yǎng)1 周。SHR隨機分為2 組，每組8 只，分別灌胃在1 kg酸奶中含有3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A的酸奶及3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A的酸奶，灌胃劑量3.33 g/kg，每隔4 h灌胃1 次，每天2 次，測定灌胃后2、4、6、8 h時SHR的SBP。

1.3.2.3 動物血壓測定

采用BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計，測定SHR的SBP[33]。測定前，將SHR固定于鼠網(wǎng)保溫套中39 ℃恒溫預(yù)熱，使尾動脈擴張，血流暢通。每只SHR的SBP連續(xù)測3 次，對測得的SBP進行讀數(shù)，取有效數(shù)據(jù)記錄[34]。

1.3.3 添加CH-A和PSPE-A酸奶對肝臟指標(biāo)影響

1.3.3.1 實驗動物分組

12 周齡雄性SHR 80 只，體質(zhì)量為（256±12）g，分籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，保持環(huán)境溫度（23±1）℃，相對濕度（60±5）%，預(yù)飼養(yǎng)一周，按體質(zhì)量隨機分為10 組，每組8 只。分別為正常對照組（生理鹽水，灌胃劑量3.33 g/kg）、酒精性肝損傷模型組、普通酸奶組（灌胃劑量3.33 g/kg）、聯(lián)苯雙酯陽性對照組（灌胃劑量150.0 mg/kg）、不同劑量PSPE-A組（灌胃劑量5.0 mg/kg和10.0 mg/kg）、CH-A組（灌胃劑量10.0 mg/kg和20.0 mg/kg）、1 kg酸奶中含有3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A組及含有3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A組（灌胃劑量3.33 g/kg）。

各種樣品按照設(shè)計的劑量，每日灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d。最后一天灌胃各樣品1 h后，按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003）》，對酒精性肝損傷模型組和樣品組SHR給予體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液12 mL/kg灌胃，正常對照組給予同體積生理鹽水灌胃，禁食（自由飲水）。

1.3.3.2 血清和肝組織相關(guān)指標(biāo)測定

將各樣品組灌胃體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后，禁食，16 h后各個劑量組SHR摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝入EP管，檢測血清中AST、ALT和TG等指標(biāo)。

迅速脫臼處死SHR后，取肝臟右葉的小塊肝組織，以冷的生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝組織勻漿液，檢測肝組織中的MDA和GSH含量。

檢測方法分別按照AST、ALT、TG、GSH、MDA試劑盒說明書的步驟。

1.3.3.3 肝臟病理組織學(xué)檢測

剪下肝臟左葉相同部位浸于體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液中，做肝臟組織病理研究。重點觀察脂滴在肝臟的分布及干細胞的損傷情況。

肝臟病理組織切片與染色：固定→洗滌脫水→透明→浸蠟包埋→切片、展片、貼片→脫蠟→復(fù)水→染色→脫水→復(fù)染→脫水→透明封膠[35]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 17.0軟件對結(jié)果進行分析，結(jié)果采用 ±s表示。應(yīng)用配對t檢驗分析各組之間差異的顯著性，P＜0.05表明有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加CH-A和PSPE-A對乳酸菌生長的影響2.1.1 乳酸菌菌落數(shù)與OD600nm的關(guān)系曲線

根據(jù)方法1.3.1.3節(jié)制作乳酸菌菌落數(shù)與OD600nm的關(guān)系曲線，擬合菌落對數(shù)（y）和OD600nm（x）關(guān)系曲線為y＝1.684 8x+7.135 7，R2＝0.939 45。

2.1.2 添加CH-A和PSPE-A對乳酸菌生長的影響

將不同劑量的CH-A和PSPE-A添加到乳酸菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)乳酸菌，結(jié)果見圖1。當(dāng)單獨添加CH-A時，其對乳酸菌的生長有促進作用；當(dāng)添加PSPE-A后，對乳酸菌的生長有一定的抑制作用[36-38]，且隨著PSPE-A添加量的增加，抑制作用增強。因此，在酸奶發(fā)酵過程中添加紫薯花青素要注意添加量對乳酸菌生長的影響。在添加PSPE-A量較大時，可采用發(fā)酵后添加，以免影響發(fā)酵的效果。

圖1 不同劑量CH-A和PSPE-A對乳酸菌生長的影響Fig. 1 Effect of different dosage of CH-A and PSPE-A on the growth of lactic acid bacteria

2.2 添加CH-A和PSPE-A對酸奶發(fā)酵的影響

表1 添加CH-A和PSPE-A對酸奶發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 1 Effect of adding CH-A and PSPE-A on quality of fermented milk

將CH-A和PSPE-A按照設(shè)計的量與原料乳混合，按照普通酸奶的發(fā)酵工藝進行發(fā)酵，在43℃下發(fā)酵5.5h，檢測發(fā)酵乳的酸度、活菌數(shù)，并對質(zhì)構(gòu)進行分析，結(jié)果見表1。1號樣品為每升添加0.0 g CH-A+0.0 g PSPE-A組，2號樣品為每升添加3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A組，3號樣品為每升添加3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A組。

與1號樣品進行對比，添加CH-A和PSPE-A的酸奶的酸度、活菌數(shù)都有所降低，但無顯著差異，且隨著PSPE-A添加量的增加，逐漸降低，但無顯著差異，該結(jié)果與圖1的結(jié)果有較大差異，該差異可能是由乳成分的影響產(chǎn)生的。作為凝固型酸奶，3 種樣品的硬度雖然無顯著性差異，但2號與3號樣品相比，隨著PSPE-A的添加量增加，其硬度有所下降，這與PSPE-A對乳酸菌生長的影響有關(guān)；2號、3號樣品酸奶的稠度和黏度均有顯著降低，且隨著PSPE-A添加量的增加，其降低程度增加。

綜合分析，添加PSPE-A會影響乳酸菌的生長，從而導(dǎo)致酸度、硬度、黏度及稠度等指標(biāo)的下降，且PSPE-A添加量越多，影響就越大。因此，在添加PSPE-A生產(chǎn)發(fā)酵酸奶時，要注意其對發(fā)酵效果的影響。

2.3 含有CH-A和PSPE-A酸奶降血壓效果

2.3.1 單次灌胃酸奶含有CH-A和PSPE-A對SHR血壓的影響

含有不同添加量的CH-A和PSPE-A發(fā)酵酸奶，以3.33 g/kg的劑量灌胃SHR，其SBP的變化見圖2。各樣品組都具有降血壓作用，含有CH-A和PSPE-A組與0.0 g CH-A+0.0 g PSPE-A組比較有顯著差異（P＜0.05）。0.0 g CH-A+0.0 g PSPE-A組在灌胃后3 h達到最低，SBP下降了（9.10±2.88）mm Hg。而含有3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A組、3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A組在灌胃后4 h達到最低，SBP分別下降了（23.13±2.41）、（26.23±1.44）mm Hg。然后SBP緩慢回升。表明添加了CH-A和PSPE-A的發(fā)酵酸奶具有顯著的輔助降血壓作用。

圖2 含有CH-A與PSPE-A的酸奶對SHR血壓的影響Fig. 2 Effect of yogurt containing CH-A and PSPE-A on SBP of SHR

圖3 含有CH-A與PSPE-A的酸奶對Wistar大鼠血壓的影響Fig. 3 Effect of yogurt containing CH-A and PSPE-A on SBP of Wistar rats

將含有不同添加量的CH-A和PSPE-A酸奶以相同劑量灌胃Wistar大鼠，其SBP變化見圖3。添加CH-A和PSPE-A的酸奶對正常大鼠的SBP無影響。

2.3.2 每天兩次灌胃含有CH-A和PSPE-A的酸奶對SHR血壓的影響

圖4 連續(xù)灌胃含CH-A與PSPE-A的酸奶對SHR血壓的影響Fig. 4 Effect of continuous administration of yogurt containing CH-A and PSPE-A on SBP of SHR

將添加CH-A和PSPE-A的酸奶，間隔4 h灌胃1 次，每天灌胃2 次，SHR血壓變化見圖4。在灌胃后2 h，3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A組、3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A組的SHR SBP分別降低了（9.31±3.24）、（10.17±3.97）mm Hg。4 h后其血壓分別降低了（23.40±3.12）、（26.58±2.92）mm Hg。然后進行第2次灌胃，灌胃后其血壓均維持在較低的水平，6 h后SHR血壓分別下降至（24.81±2.81）mm Hg和（28.92±4.30）mm Hg，并且在8 h時，依然保持相對較低的水平。這表明含有CH-A和PSPE-A的酸奶不僅有較好的降血壓效果，如果按照一定的時間間隔進行服用，還能夠維持血壓的相對穩(wěn)定。

2.4 含有CH-A和PSPE-A酸奶對肝臟指標(biāo)影響

2.4.1 含有CH-A和PSPE-A酸奶對SHR血清與肝組織相關(guān)指標(biāo)的影響

將不同劑量的CH-A和PSPE-A及添加后所制備的酸奶，按照設(shè)計的劑量灌胃SHR。以聯(lián)苯雙酯為陽性對照組，按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003）》[39]，造模并評價對SHR血清和肝組織相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果見表2、3。酒精性肝損傷模型組SHR血清中的ALT、AST、TG和肝組織中的GSH、MDA等5 個指標(biāo)水平與正常對照組比較差異極顯著（P＜0.01），模型建立成功，表明后續(xù)實驗可以使用這個劑量（體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液12 mL/kg）建立酒精性肝損傷模型。

普通酸奶組：與正常對照組相比，SHR血清的AST、ALT和TG 3 個指標(biāo)水平差異極顯著（P＜0.01），肝組織中GSH和MDA水平存在極顯著差異（P＜0.01）。與酒精性肝損傷模型組相比，5 個指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。因此，普通酸奶沒有護肝作用。

聯(lián)苯雙酯組：與正常對照組相比，SHR血清的AST和ALT水平無顯著差異（P＞0.05），TG水平差異極顯著（P＜0.01）；肝組織中的GSH和MDA水平差異極顯著（P＜0.01）。與酒精性肝損傷模型組相比，AST水平差異極顯著（P＜0.01），ALT水平差異顯著（P＜0.05），TG、GSH和MDA水平無顯著差異（P＞0.05）；因此，該藥物可通過作用轉(zhuǎn)氨酶起到護肝作用。

PSPE-A組（灌胃劑量5.0 mg/kg）：與正常對照組相比，AST、ALT、MDA水平無顯著差異（P＞0.05）；TG和GSH水平差異顯著（P＜0.05）；與酒精性肝損傷模型組相比，AST、ALT水平差異極顯著（P＜0.01），MDA水平差異顯著（P＜0.05），TG和GSH水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，5 個指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）；因此，在該劑量下PSPE-A（花青素含量9.25%）具有護肝作用。

PSPE-A組（灌胃劑量10.0 mg/kg）：與正常對照組相比，AST、ALT、MDA水平無顯著差異（P＞0.05）；TG和GSH水平差異顯著（P＜0.05）。與酒精性肝損傷模型組相比，AST、ALT、MDA水平差異極顯著（P＜0.01），TG和GSH水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，5 個指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）；因此，在該劑量下PSPE-A（花青素含量9.25%）具有護肝作用。

CH-A組（灌胃劑量10.0 mg/kg）：與正常對照組相比AST、ALT水平無顯著差異（P＞0.05），TG水平差異顯著（P＜0.05），GSH和MDA水平差異極顯著（P＜0.01）。與酒精性肝損傷模型組相比，AST水平差異極顯著（P＜0.01），ALT水平差異顯著（P＜0.05），TG、GSH和MDA水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，5 個指標(biāo)水平均無顯著差異（P＞0.05）；因此，CH-A對AST和ALT有降低作用。

表2 含兩種功能性成分的酸奶對SHR血清AST、ALT和TG水平的影響Table 2 Effect of yogurt containing CH-A and PSPE-A on the contents of AST, ALT and TG in serum of SHR

表3 含CH-A和PSPE-A的酸奶對SHR肝組織GSH、MDA含量的影響Table 3 Effect of yogurt containing CH-A and PSPE-A on the contents of GSH and MDA in liver tissues of SHR

CH-A組（灌胃劑量20.0 mg/kg）：與正常對照組相比，AST、ALT和TG水平無顯著差異（P＞0.05），GSH和MDA水平差異極顯著（P＜0.01）；與酒精性肝損傷模型組相比，AST水平差異極顯著（P＜0.01），ALT、TG水平差異顯著（P＜0.05），GSH和MDA水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，5 個指標(biāo)水平均無顯著差異（P＞0.05）；因此，在該劑量下，CH-A具有護肝作用。

添加3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A酸奶組：與正常對照組相比AST、ALT、MDA水平無顯著差異（P＞0.05），TG、GSH水平差異顯著（P＜0.05）；與酒精性肝損傷模型組相比，AST、ALT水平差異極顯著（P＜0.01），MDA水平差異顯著（P＜0.05），TG、GSH水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，AST水平差異顯著（P＜0.05），其他指標(biāo)水平無顯著差異；因此，含有該劑量CH-A和PSPE-A的酸奶具有護肝作用。

添加3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A酸奶組：與正常對照組相比，AST、ALT、TG、MDA水平無顯著差異（P＞0.05），GSH水平差異顯著（P＜0.05）；與酒精性肝損傷模型組相比，AST、ALT、TG、MDA水平差異極顯著（P＜0.01），GSH水平無顯著差異（P＞0.05）。與聯(lián)苯雙酯組相比，除了GSH水平無差異外，其他指標(biāo)均優(yōu)于對照組（P＜0.05，P＜0.01）；因此，添加該劑量的CH-A和PSPE-A的酸奶具有護肝作用。

綜合表2、3的結(jié)果，CH-A（有效ACE抑制肽含量10%）、PSPE-A（花青素含量9.25%）以及添加兩種原料所制備的酸奶，在實驗劑量范圍內(nèi)具有護肝作用。

2.4.2 肝臟病理組織學(xué)檢測

圖5 添加CH-A和PSPE-A酸奶對SHR肝臟組織的影響（10×40 倍）Fig. 5 Effect of yogurt containing CH-A and PSPE-A on liver tissues ofSHR (10 × 40)

由于過量飲酒會造成肝組織的損傷，同時，還會造成脂肪代謝障礙，導(dǎo)致脂肪在肝臟細胞內(nèi)沉積，造成脂肪肝[39]。通過觀察不同樣品對SHR肝臟組織的影響（圖5），正常對照組的肝細胞結(jié)構(gòu)完整，呈多邊形，肝細胞之間的界限明顯，具有規(guī)則，細胞核位于肝細胞的中央，形態(tài)正常，基本沒有壞死的細胞，且肝組織細胞內(nèi)幾乎沒有脂肪的沉積。酒精性肝損傷模型組中，大部分肝細胞凋亡或壞死，細胞核變形，細胞質(zhì)流失，基本無正常細胞結(jié)構(gòu)。聯(lián)苯雙酯組細胞雖然保持相對完整，但組織間和細胞內(nèi)沉積較多脂肪。普通酸奶組中，細胞結(jié)構(gòu)變形，且細胞內(nèi)沉積較多的脂肪。灌胃劑量為5 mg/kg的PSPE-A組，細胞相對完整，大部分細胞內(nèi)沉積脂肪。灌胃劑量為10 mg/kg的PSPE-A組，細胞完整，部分細胞內(nèi)沉積脂肪。灌胃劑量為10 mg/kg和20 mg/kg的CH-A組，部分細胞結(jié)構(gòu)被破壞，且組織間和細胞內(nèi)沉積脂肪。灌胃添加3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A酸奶組，細胞結(jié)構(gòu)完整，組織間有脂肪沉積，但細胞內(nèi)沉積脂肪量較少。灌胃添加3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A酸奶組，細胞結(jié)構(gòu)完整，組織間有少量脂肪沉積，有部分細胞內(nèi)有少量脂肪沉積。因此，通過肝組織病理切片觀察可知，添加CH-A和PSPE-A的酸奶，在實驗劑量范圍內(nèi)對肝臟有保護作用。

3 結(jié) 論

添加CH-A（含有效ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）和PSPE-A（花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.25%）制備發(fā)酵酸奶，在實驗的劑量范圍內(nèi)有較好的降血壓和保護肝臟的作用。當(dāng)1 kg酸奶中含有3.0 g CH-A+3.0 g PSPE-A時，對SHR的血壓有顯著降低作用，且對肝組織和血清中AST、ALT、TG、MDA 4 個指標(biāo)水平均有顯著改善作用（P＜0.05）；1 kg中含有3.0 g CH-A+1.5 g PSPE-A酸奶，對SHR的血壓有顯著降低作用，且對肝組織和血清中AST、ALT、MDA 3 個指標(biāo)水平有顯著改善作用（P＜0.05）。通過肝組織病理切片觀察，兩種酸奶對肝細胞和脂肪代謝均有改善作用。

參考文獻：

[1] 揭紅波. 淺談心血管疾病的發(fā)病機理與預(yù)防[J]. 中外醫(yī)療, 2011,30(12): 184. DOI:10.16662/j.cnki.1674-0742.2011.12.071.

[2] 桑甜, 丁淑貞, 路巖, 等. 原發(fā)性高血壓患者自我管理及護理干預(yù)研究進展[J]. 中國護理管理, 2017, 17(3): 401-405. DOI:10.3969/j.issn.1672-1756.2017.03.027.

[3] 康玉明, 李宏寶, 齊杰, 等. 高血壓中樞發(fā)病機制的研究進展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2017, 38(1): 1-6. DOI:10.7652/jdyxb201701001.

[4] 池肇春. 非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制研究進展與現(xiàn)狀[J]. 世界華人消化雜志, 2017, 25(8): 670-683. DOI:10.11569/wcjd.v25.i8.670.

[5] 劉國濤, 張濤, 王進, 等. 酒精性肝病研究進展[J]. 世界華人消化雜志, 2017, 25(15): 1382-1388. DOI:10.11569/wcjd.v25.i15.1382.

[6] 鄭盛, 唐映梅, 楊晉輝. 原發(fā)性高血壓伴發(fā)非酒精性脂肪性肝病的多代謝異常[J]. 臨床內(nèi)科雜志, 2014, 31(8): 550-552. DOI:10.16439/j.cnki.1673-7245.2015.02.040.

[7] 趙文革, 史昌河. 非酒精性脂肪性肝病與高血壓的關(guān)系[J]. 臨床醫(yī)藥文獻雜志, 2016, 3(31): 6124-6125. DOI:10.16281/j.cnki.jocml.2016.31.006.

[8] 趙宇, 楊莉莉, 尹璐, 等. 老年非酒精性脂肪性肝病與原發(fā)性高血壓的關(guān)系[J]. 中華高血壓雜志, 2011, 19(10): 929-932. DOI:10.16439/j.cnki.1673-7245.2011.10.035.

[9] 張茂云, 牟宗毅. 非藥物療法治療老年性高血壓的研究進展[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(2): 461-464. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2013.02.113.

[10] ZHANG Z F, LU J, ZHENG Y L, et al. Purple sweet potato color protects mouse liver against D-galactose-induced apoptosis via inhibiting caspase-3 activation and enhancing PI3K/Akt pathway[J].Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(8/9): 2500-2507.DOI:10.1016/j.fct.2010.06.023.

[11] HWANG Y P, CHOI J H, CHOI J M, et al. Protective mechanisms of anthocyanins from purple sweet potato against tert-butyl hydroperoxide-induced hepatotoxicity[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(9): 2081-2089. DOI:10.1016/j.fct.2011.05.021.

[12] CHOI J H, HWANG Y P, CHOI C Y, et al. Anti-fibrotic effects of the anthocyanins isolated from the purple-fleshed sweet potato on hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine administration in mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(11): 3137-3143.DOI:10.1016/j.fct.2010.08.009.

[13] SUDA I, ISHIKAWA F, HATAKEYAMA M, et al. Intake of purple sweet potato beverage affects on serum hepatic biomarker levels of healthy adult men with borderline hepatitis[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2008, 62(1): 60-67. DOI:10.1038/sj.ejcn.1602674.

[14] SUN H N, MU T H. Purple sweet potato (Ipomoea batatas L.)anthocyanins: preventive effect on acute and subacute alcoholic liver damage and dealcoholic effect[J]. Agriculture and Food Chemistry,2014, 62(11): 2364-2373. DOI:10.1021/jf405032f.

[15] SHINDO M, KASAI T, ABE A, et al. Effects of dietary administration of plant-derived anthocyanin-rich colors to spontaneously hypertensive rats[J]. Nutrition Science Vitaminol, 2007, 53(1): 90-93. DOI:10.3177/jnsv.53.90.

[16] 胡志和, 張然嬉, 馮永強, 等. 提取紫薯淀粉的副產(chǎn)物對SHR血壓的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(21): 361-364.

[17] 孟文, 賀煒, 鐘英麗, 等. 紫甘薯花青素體外抑制α-糖苷酶活性研究[J].食品科學(xué), 2011, 32(17): 32-36.

[18] MATSUI T, UEDA T, OKI T, et al. α-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins. 1. survey of natural pigments with potent inhibitory activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4): 1948-1951. DOI:10.1021/jf001251u.

[19] MATSUI T, EBUCHI S, KOBAYASHI M, et al. Anti-hyperglycemic effect of diacylated anthocyanin derived from Ipomoea batatas cultivar ayamurasaki can be achieved through the α-glucosidase inhibitory action[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(25):7244-7248. DOI:10.1021/jf025913m.

[20] MATSUI T, UEDA T, OKI T, et al. α-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins. 2. α-glucosidase inhibition by isolated acylated anthocyanins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4): 1952-1956. DOI:10.1021/jf0012502.

[21] TEOW C C, TRUONG V D, MCFEETERS R F, et al. Antioxidant activities, phenolic and β-carotene contents of sweet potato genotypes with varying flesh colours[J]. Food Chemistry, 2007, 103(3): 829-838.DOI:10.1016/j.foodchem.2006.09.033.

[22] KANO M, TAKAYANAGI T, HARADA K, et al. Antioxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato, Ipomoera batatas cultivar Ayamurasaki[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,2005, 69(5): 979-988. DOI:10.1271/bbb.69.979.

[23] HAN K, SEKIKAWA M, SHIMADA K, et al. Anthocyanin rich purple potato flake extract has antioxidant capacity and improves antioxidant potential in mice[J]. British Journal of Nutrition, 2006,96(6): 1125-1133. DOI:10.1017/BJN20061928.

[24] HAN Y T, CHEN X H, XIE J, et al. Purple sweet potato pigments scavenge ROS, reduce p53 and modulate Bcl-2/Bax to inhibit irradiation-induced apoptosis in murine thymocytes[J].Cellular Physiology and Biochemistry, 2011, 28: 865-872.DOI:10.1159/000335801.

[25] 姜云發(fā), 丁濤, 朱忠寧, 等. 葡萄籽原花青素對兔動脈粥樣硬化血管病理形態(tài)的影響[J]. 河北醫(yī)藥, 2016, 38(3): 338-340. DOI:10.3969/.j.issn.1002-7386.2016.03.004.

[26] JU J H, YOON H S, PARK H J, et al. Anti-obesity and antioxidative effects of purple sweet potato extract in 3T3-L1 adipocytes in vitro[J].Journal of Medicinal Food, 2011, 14(10): 1097-1106. DOI:10.1089/jmf.2010.1450.

[27] 王佳佳, 胡志和, 蔣毅. 富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其功能性酸乳對SHR血壓的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(10): 345-351;356. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.10.075.

[28] 朱明燕, 柳景景, 石雷. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑研究進展與臨床應(yīng)用[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2011, 8(1): 9-10.

[29] 張葉, 劉景陶, 王強, 等. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑研究進展[J]. 科技創(chuàng)新與應(yīng)用, 2016(35): 84.

[30] 夏磊, 胡志和, 李艷軍. 含血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的酪蛋白水解物與紫薯提取物聯(lián)用對原發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(19): 243-248. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619041.

[31] 趙勇, 胡志和, 孫振剛, 等. RP-HPLC法測定酪蛋白水解物中ACE抑制肽的含量[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(10): 54-58. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.002.

[32] 李思寧. 紫薯酸乳發(fā)酵工藝研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2011, 47(4):101-103.

[33] 張燕, 王紅英, 胡艷君, 等. SHR大鼠血壓尾套法測定影響因素探討[J].西北藥學(xué)雜志, 2008, 23(2): 94-95.

[34] 王茵, 劉淑集, 蘇永昌, 等. 紫菜降血壓肽大鼠體內(nèi)降壓效果研究[J].中國海洋藥物雜志, 2010, 29(3): 17-21. DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2010.03.005.

[35] 王春梅, 李賀, 李生, 等. 北五味子木脂素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(13): 262-265.

[36] 韓永斌, 朱洪梅, 顧振新, 等. 紫甘薯花色苷色素的抑菌作用研究[J].微生物學(xué)通報, 2008, 35(6): 913-917.

[37] 韓永斌, 朱洪梅, 顧振新, 等. 紫甘薯花色苷色素抑制金黃色葡萄球菌作用初探[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 59-62.

[38] 張俊, 程衛(wèi)東, 史學(xué)偉, 等. 紫胡蘿卜花青素提取工藝及其體外抗菌活性研究[J]. 中國調(diào)味品, 2016, 41(11): 140-144; 151. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2016.11.033.

[39] 衛(wèi)生部. 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[A]. 2003版. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部, 2003: 133-139.