不同小白菜品種硝酸鹽含量、氮代謝關(guān)鍵酶活性及NRT1表達和亞細胞定位

李彥華，楊 蕓，徐衛(wèi)紅*，周鑫斌，王衛(wèi)中，遲蓀琳，李 桃，張春來，趙婉伊，秦余麗，王正銀，謝德體

蔬菜極易累積硝酸鹽，在人體所攝入的硝酸鹽中，其貢獻高達72%～94%[1-2]。雖然過量的硝酸鹽對植物無害，但大量的NO3-通過食物鏈進入人體腸胃后，可經(jīng)細菌的作用還原為亞硝酸或與胺反應(yīng)生成亞硝胺，從而可能使血液載氧能力降低、誘發(fā)人體消化系統(tǒng)癌變等[3-6]。目前我國不少大城市葉類蔬菜的硝酸鹽含量偏高，部分地區(qū)高達3 000 mg/kg[7]。氮肥的不合理施用被認為是作物硝酸鹽積累的原因，蔬菜中的硝酸鹽含量會隨氮肥施用量的增加迅速升高[8]。而且，不同形態(tài)的氮肥（如銨態(tài)氮和硝態(tài)氮）及其比例是影響蔬菜硝酸鹽含量的重要因素[9-10]。有研究表明，增加銨態(tài)氮含量可以顯著降低葉類蔬菜莖葉中硝酸鹽的含量[11-13]。

不同種蔬菜及同種蔬菜的不同品種間硝酸鹽含量有差異[13]，且硝酸鹽積累量的差異變幅可高達1 600 mg/kg[14]。硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）活性、硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（nitrate transporter，NRT）等遺傳因子差異是造成積累差異的主要原因；其中，NRT基因?qū)τ诘匚?、運輸和同化有著重要作用，是提高作物氮素利用效率，解決硝酸鹽積累的重要研究對象[11]。NO3-—N主要是通過低親和的NRT1和高親和的NRT2而被高等植物吸收，且這兩類轉(zhuǎn)運體基因已在擬南芥、水稻和番茄中得到克隆[15]。而目前有關(guān)蔬菜NRT基因的表達和亞細胞定位，以及硝銨比、氮代謝酶與蔬菜的硝酸鹽含量相關(guān)性的研究報道較少，且結(jié)果不一致[16-18]。

小白菜（Brassica chinensis L.）是我國最重要的葉類蔬菜之一。都韶婷等[7]檢測了我國多個城市的主要蔬菜硝酸鹽含量，發(fā)現(xiàn)小白菜是硝酸鹽含量最高的蔬菜之一，其中北京和長沙地區(qū)的硝酸鹽含量分別高達3 615 mg/kg和3 514 mg/kg，超出了葉類蔬菜的硝酸鹽限量標準；因此，本研究采用液體培養(yǎng)實驗，以低硝酸鹽富集品種‘香港特選奶白菜’和高硝酸鹽富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’為供試材料，系統(tǒng)探討了硝銨比對2 種小白菜硝酸鹽含量、氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響及NRT基因的表達和亞細胞定位在小白菜不同品種間的差異，初步明確硝酸鹽積累的生理及分子機理；同時也為蔬菜生產(chǎn)中的氮肥運籌及栽培品種合理選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試作物為小白菜，品種為前期實驗中篩選出的低硝酸鹽富集品種‘香港特選奶白菜’和高硝酸鹽富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’[19]。

小量RNA抽提試劑盒 華舜生物公司；Taq DNA聚合酶 上海鼎國公司；RNase Free-DNaseⅠ、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、高保真酶Pfu、dNTP 日本TaKaRa公司；Trizol RNA提取試劑盒 美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV） 美國Fermentas公司；PCR合成試劑 上海生工生物工程公司；膠回收試劑盒美國Axygen公司；酶解液、PEG4000溶液、W5溶液、MMG溶液 武漢伯遠生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI-9700聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Nanodrop2000紫外-可見分光光度計 美國Thermo Scientific公司；HE99電泳儀 美國GE公司；WD-9403C紫外透射儀 北京市六一儀器廠；LSM700激光共聚焦顯微鏡 德國Zeiss公司。

1.3 方法

實驗共設(shè)3 個硝銨比處理組（c（NO3-）∶c（NH4+）分別為50∶50、75∶25和100∶0），營養(yǎng)液按霍格蘭營養(yǎng)液配方配制，氮濃度為16 mmol/L，調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，具體操作參見文獻[19]。

1.3.1 植株硝酸鹽含量及氮代謝關(guān)鍵酶活力測定

硝酸鹽含量的測定采用GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法；NR活力測定采用活體法[20-21]；亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）活力測定參照Ozawa等[22]的方法；谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活力參照植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[23]測定；谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）活力參照葉利庭等[24]的方法測定。

1.3.2 熒光定量PCR

1.3.2.1 總RNA提取與檢測

采用華舜生物公司的小量RNA抽提試劑盒提取，并通過電泳結(jié)果以及RNA濃度綜合評價RNA的質(zhì)量。

1.3.2.2 RNA的純化與反轉(zhuǎn)錄

使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，并采用RNase Free-DNaseⅠ除去RNA中微量的DNA。將所得的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 引物設(shè)計與合成

本實驗研究硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運蛋白基因NRT1。由武漢伯遠生物技術(shù)公司設(shè)計并合成NRT1基因的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-PCR特異引物，內(nèi)參引物為actin-F/R（表1）。

表1 NRT1基因的RT-PCR引物Table 1 Primers used for RT-PCR of NRT1

1.3.2.4 cDNA的PCR擴增

取獲得的cDNA，用ABI-9700 PRC儀進行特異擴增。反應(yīng)體系的總體積為25 μL，包括2.5 μL 10×Buffer（含Mg2+）、0.5 μL dNTP（10 mmol/L）、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL、cDNA模板0.25 μL，剩余部分用ddH2O補足。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性40 s，退火（溫度為55 ℃）1 min，72 ℃ 45 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并用紫外透射儀拍照。

1.3.2.5 實時熒光定量PCR

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用ddH2O稀釋25 倍，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進行qRT-PCR，檢測其特異性。操作方法參照使用說明書進行，每個試樣重復(fù)3 次。

1.3.3 NRT1亞細胞定位

菌種：大腸桿菌用作質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化宿主；質(zhì)粒：pBWA(V)H-YFPNR1；融合表達載體的構(gòu)建：參照楊學(xué)東等[25]的NRT1序列設(shè)計引物，以NRT1克隆為模板用高保真酶Pfu進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后連接到pBWA(V)H-YFPNR1載體上，獲得最終表達載體（圖1）。

圖1 原生質(zhì)體亞細胞定位載體圖譜Fig. 1 Map of the protoplast subcellular localization vector

質(zhì)粒定位原生質(zhì)體：取小白菜葉用水沖洗表面污垢，在干凈塑料/玻璃板上用鋒利的刀片切成碎段（長度小于0.5 mm），總質(zhì)量5～10 g左右。加入5～10 mL酶解液全部浸泡組織，28 ℃緩慢振蕩（100 r/min）酶解5～6 h。將原生質(zhì)體用40 μm濾網(wǎng)進行過濾，然后50×g離心10 min，可見渾濁沉淀。直接倒去上清液，用預(yù)冷W5溶液10 mL洗滌2 次，每次50×g離心5 min，可見管底渾濁沉淀。根據(jù)需要加入500 μL MMG溶液稀釋原生質(zhì)體得到原生質(zhì)體原液。使其在40 倍下顯微鏡檢測每個視野20～40 個左右。取200 μL原生質(zhì)體懸液原液，等體積的PEG溶液及500 ng以上的純化質(zhì)粒進行輕柔均勻混合，室溫靜置30 min，用1 mL W5稀釋，混合均勻終止反應(yīng)，100×g離心5 min收集原生質(zhì)體，加入1 mL W5洗1～2 次，最后加入1 mL W5溶液重懸，轉(zhuǎn)移到2 mL EP管中，28 ℃暗培養(yǎng)24～48 h，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計處理，利用Duncan’s新復(fù)極差法做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝銨比對不同品種小白菜各部位硝酸鹽含量的影響

圖2 硝銨比對不同品種小白菜葉（A）、葉柄（B）、根（C）硝酸鹽含量的影響Fig. 2 Effect of NO3－/NH4＋ ratio on nitrate contents in leaves (A),petioles (B) and roots (C) of two varieties of pakchoi

從圖2可以看出，在不同硝銨比處理下，小白菜硝酸鹽含量為葉柄＞葉＞根。隨NO3-比例的增加，小白菜葉柄、葉和根硝酸鹽含量總體呈增加趨勢。在硝銨比75∶25和100∶0處理中，‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片硝酸鹽含量分別較硝銨比50∶50處理增加了7.9%～13.2%和29.1%～30.4%，葉柄硝酸鹽含量分別較硝銨比50∶50處理增加了0.3%～14.3%和3.3%～4.9%，根硝酸鹽含量分別較硝銨比50∶50處理增加了45.4%～73.8%和9.8%～63.3%。相同硝銨比處理下，‘香港特選奶白菜’葉、葉柄和根中的硝酸鹽含量均明顯低于‘揭農(nóng)四號春白菜’。

2.2 硝銨比對不同品種小白菜氮代謝相關(guān)酶活性的影響

圖3 不同硝銨比對2 個品種小白菜葉片NR（A）、NiR（B）、GS（C）、GOGAT（D）、GDH（E）活力的影響Fig. 3 Effect of NO3－/NH4＋ ratio on the activities of NR (A), NiR (B),GS (C), GOGAT (D) and GDH (E) in leaves of two varieties of pakchoi

由圖3可知，隨著硝銨比的增加小白菜葉片NR活力呈現(xiàn)降低趨勢，在硝銨比75∶25和100∶0處理中，‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片NR活性分別較硝銨比50∶50處理降低了15.5%～26.6%和21.9%～26.5%?！愀厶剡x奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片NiR活力隨著硝銨比的增加有所增加，硝銨比75∶25和100∶0處理分別較硝銨比50∶50處理增加了38.9%～57.3%和5.1%～74.9%。小白菜葉片GOGAT活力隨著硝銨比的增加呈現(xiàn)降低趨勢，硝銨比75∶25和100∶0處理‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片GOGAT活力分別較硝銨比50∶50處理降低了10.5%～15.5%和0.2%～24.6%。隨著硝銨比的增加小白菜葉片GDH活力呈先增加后降低趨勢，‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片GDH活力在75∶25時達到最大值，分別較硝銨比50∶50處理增加了2.1%和20.0%。而不同硝銨比對2 個品種小白菜的GS活力沒有顯著影響。不同硝銨比處理中，除硝銨比50∶50處理下的NiR、GDH活力外，其他氮代謝相關(guān)酶活力在兩個小白菜品種之間達到顯著性差異。

2.3 小白菜NRT1基因表達分析

高等植物有兩種細胞質(zhì)膜NRT，即NRTl和NRT2。NRT2是高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（high-affinity transport system，HATs），而大部分NRTl是低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（low-affinity transport system，LATs）。根據(jù)以上實驗結(jié)果分別選擇高硝酸鹽富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’和低硝酸鹽富集品種‘香港特選奶白菜’為材料，對其葉片部位的RNA進行實時熒光定量PCR。如圖4所示，NRT1在‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片中均有表達；以‘香港特選奶白菜’NRT1的平均相對表達量為1.00，‘揭農(nóng)四號春白菜’的NRT1的平均相對表達量為2.47，‘揭農(nóng)四號春白菜’的NRT1相對表達量顯著高于‘香港特選奶白菜’，且2 個白菜品種葉片中NRT1表達量組內(nèi)差異均較大。但未檢測出NRT2表達量。

圖4 小白菜葉片中NRT1實時定量熒光PCR分析Fig. 4 Real-time PCR analysis of NRT1-associated genes in leaves of pakchoi

2.4 小白菜NRT1亞細胞定位

圖5 NRT1在小白菜葉片原生質(zhì)體中的亞細胞定位Fig. 5 Subcellular localization of NRT1 in pakchoi protoplasts

通過生物信息學(xué)方法分析蛋白可能的信號肽或功能域來確定蛋白在細胞內(nèi)的定位，有利于高效地探索蛋白的功能。近年來綠色熒光蛋白被廣泛應(yīng)用于基因表達、蛋白質(zhì)定位等領(lǐng)域。當其在細胞中表達時，若遇到藍光或紫外光，便會產(chǎn)生明亮的綠色熒光。為了研究NRT1在植物細胞中的作用部位，以高硝酸鹽富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’和低硝酸鹽富集品種‘香港特選奶白菜’為材料，構(gòu)建了原生質(zhì)體表達載體。如圖5所示，NRT1在小白菜葉片原生質(zhì)體中的亞細胞定位結(jié)果表明，NRT1在原生質(zhì)膜上大量表達，而在原生質(zhì)體內(nèi)并無表達，說明NRT1是定位于原生質(zhì)體細胞膜上的非跨膜蛋白。

3 討 論

艾紹英等[26]研究發(fā)現(xiàn)適當增加營養(yǎng)液中銨態(tài)氮的比例可有效降低菜心中的硝酸鹽含量。在本實驗中，2 個品種小白菜葉片、葉柄和根的硝酸鹽含量隨著銨態(tài)氮比例的增加而降低，隨硝態(tài)氮比例的增加而增加。Ullrich[27]認為其可能的原因是銨能夠高速進入細胞，而導(dǎo)致細胞膜去極化，阻止了H+與陰離子的協(xié)同運輸，因此抑制了硝酸鹽的吸收；也可能是因為受到了溫度、光照等外部因素的影響[28-31]。供試2 個品種小白菜體內(nèi)硝酸鹽含量表現(xiàn)為葉柄＞葉片＞根，這與Chen Wei等[32]報道一致。Gransteck等[33]認為這是由于根和葉主要承擔物質(zhì)的吸收和同化的作用，進入根部后的NO3-部分被同化為營養(yǎng)物質(zhì)，而大部分NO3-則在蒸騰拉力的作用下經(jīng)由木質(zhì)部輸送到葉片、果實等地上部位，參與各種生理代謝。供試低硝酸鹽富集品種‘香港特選奶白菜’，高富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’，2 個小白菜品種之間葉片硝酸鹽含量相差1.22～1.46 mg/kg，葉柄硝酸鹽含量相差1.21～1.40 mg/kg，根硝酸鹽含量相差1.80～2.38 mg/kg，這種蔬菜種間、品種間硝酸鹽積累差異原因主要由遺傳因子控制所致。有研究表明，蔬菜硝酸鹽積累較高和較低的兩極類群品種表現(xiàn)穩(wěn)定，基因型差異可穩(wěn)定遺傳[11]。

硝酸鹽被特異性的NRT高效運輸?shù)街参锔毎?，儲存在液泡里，在細胞質(zhì)中被NR降解成亞硝酸鹽。亞硝酸鹽進入根的葉綠體或非綠色組織的質(zhì)體中，在6-鐵氧還蛋白的幫助下NiR將其進一步還原成銨。隨后在ATP供能下，GS將谷氨酸和NH4+轉(zhuǎn)換成谷氨酰胺，該過程是在葉綠體、細胞質(zhì)或根細胞質(zhì)體中進行的，最終銨參與到氨基酸的合成。當植物細胞中NH4+濃度較高時，NADH提供電子，NH4+還可以由存在于葉綠體和線粒體中的GDH還原為谷氨酸。植物體內(nèi)，NR和NiR對初級氮的同化起著非常重要的作用，NR調(diào)控硝酸鹽降解為亞硝酸鹽，NiR再進一步將亞硝酸鹽降解為銨，最終銨參與到蛋白質(zhì)的合成中[34]。本實驗中，對小白菜硝酸鹽含量影響較大的是NR活性。有研究報道隨著營養(yǎng)液硝態(tài)氮的增加，蔬菜硝酸鹽含量與NR活力隨之升高[35]。而本實驗中，隨著硝銨比的增加，小白菜葉片NR活力呈下降趨勢。該結(jié)果與胡承孝等[36]報道小白菜、番茄的硝酸鹽含量與NR活力間呈負相關(guān)相似。NR作為是植物氮代謝中一個重要的限速酶和調(diào)節(jié)酶，在高硝態(tài)氮下其活性降低，可能是造成小白菜體內(nèi)硝酸鹽積累的重要原因。

NRT在植物體內(nèi)介導(dǎo)根系對NO3-的吸收以及在不同組織、器官間的轉(zhuǎn)運。高等植物共有2 個家族的轉(zhuǎn)運蛋白：NRT1和NRT2，分別與LATS和HATS有關(guān)[37]。從實時熒光定量PCR的結(jié)果來看，NRT1在‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’中均顯著表達，而未檢測出NRT2表達量。這與孔敏等[38]的結(jié)果不一致。這可能是由于NRT基因在植物組織中各器官中表達有很大的差異，且NRT2在根部表達量要比葉、花等器官中的表達量要高[39]。本實驗中，‘揭農(nóng)四號春白菜’中的NRT1相對表達量顯著高于‘香港特選奶白菜’，這與‘揭農(nóng)四號春白菜’和‘香港特選奶白菜’葉片硝酸鹽積累量差異表現(xiàn)一致。此結(jié)果與趙首萍等[15]的結(jié)果大致相同。說明NRT1的表達在一定程度上可以解釋品種間葉片硝酸鹽積累的差異原因。在本實驗中，由于在硝銨比為100∶0時兩個小白菜葉片中的硝酸鹽含量最高，且葉片是主要食用部分，因此僅對硝銨比為100∶0處理時的‘香港特選奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片進行了實時熒光定量PCR測定，僅檢測出NRT1的表達量。因此，要從根本上去探究硝酸鹽積累差異的機理，還需要對硝銨比為75∶25、50∶50的小白菜根、葉柄中的NRT1和NRT2的表達進行研究，并且研究NRT1和NRT2家族各成員在白菜各組織器官中發(fā)揮的作用對于探究小白菜中硝酸鹽積累的機理有重要意義。

NRT1表達部位與其功能密切相關(guān)，通常無機營養(yǎng)的吸收同化需要各種膜結(jié)合的離子轉(zhuǎn)運蛋白，一部分直接參與土壤中離子的吸收，而另一部分則參與離子的轉(zhuǎn)運和儲存[39]。CHL1基因的蛙卵實驗表明該基因蛋白位于細胞膜上，屬于質(zhì)子的硝酸鹽依賴共轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[40]。本研究亞細胞定位結(jié)果顯示小白菜NRTl定位于細胞膜上，是一個質(zhì)膜蛋白。說明NRT1發(fā)生功能的部位是細胞膜，這與離子轉(zhuǎn)運蛋白大部分是膜蛋白的特征一致。但是龐永奇等[41]認為目前所進行的亞細胞定位分析大多是穩(wěn)定過量表達或者瞬時表達產(chǎn)生的結(jié)果，在一定程度上可以反映蛋白質(zhì)的定位情況，但由于表達位置的不同、表達量的變化以及可能存在某些調(diào)控因子，可能不能夠真實呈現(xiàn)基因的定位情況，而采用免疫原位雜交的方法或利用自身啟動子驅(qū)動基因融合標記的表達可能會得到更準確的結(jié)果。因此，對于NRT1在細胞膜上如何發(fā)生轉(zhuǎn)運功能，還需要進一步研究。

4 結(jié) 論

供試2 個品種小白菜體內(nèi)硝酸鹽含量在不同硝銨比下均表現(xiàn)為葉柄＞葉片＞根。相同硝銨比處理下，‘香港特選奶白菜’葉、葉柄和根中的硝酸鹽含量均明顯低于‘揭農(nóng)四號春白菜’。

不同硝銨比處理中，除硝銨比50∶50處理下的NiR、GDH活力外，其他氮代謝相關(guān)酶活力在兩個小白菜品種之間均達到顯著性差異?！愀厶剡x奶白菜’和‘揭農(nóng)四號春白菜’葉片GDH活力在75∶25時均達到最大值。隨著硝銨比的增加，小白菜葉片NR、GOGAT活力呈降低趨勢，NiR活性呈上升趨勢，GDH活性呈先增加后降低趨勢。

低親和轉(zhuǎn)運蛋白基因NRT1在篩選出的兩個小白菜品種中均顯著表達，且硝酸鹽高富集品種‘揭農(nóng)四號春白菜’的表達量顯著高于低富集硝酸鹽品種‘香港特選奶白菜’。NRT1是定位于細胞膜上的低親和NRT。

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