腦苷肌肽對有機磷中毒性遲發(fā)性神經(jīng)病變大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血漿鈣激活的中性蛋白酶、神經(jīng)疾病靶標(biāo)酯酶影響研究*

王 寧，張艷盛，王夢夢

1.河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)電生理科(滄州061001)，2.河北省滄州市中心醫(yī)院檢驗科(滄州061001)

有機磷農(nóng)藥中毒不僅表現(xiàn)出膽堿酯酶活性抑制現(xiàn)象，還會表現(xiàn)出其他神經(jīng)毒性作用，這種神經(jīng)病變發(fā)生在中毒急性期以后，因此被稱為有機磷中毒性遲發(fā)性神經(jīng)病變(OPIDN)。OPIDN的臨床表現(xiàn)包括運動障礙、感覺障礙、行走困難、步態(tài)失調(diào)和一些外周神經(jīng)的組織病變[1-2]。臨床上，中毒急性期的癥狀消失之后患者中毒史容易被忽略，給OPIDN的診斷和治療帶來很多困難。有研究認為[3-4]，OPIDN的出現(xiàn)與中毒者血漿組織中神經(jīng)疾病靶標(biāo)酯酶(NTE)和鈣激活的中性蛋白酶(CANP)的水平變化存在關(guān)聯(lián)。組織中NTE受到抑制將會導(dǎo)致組織細胞出現(xiàn)“衰老”的改變，且這種改變是由CANP介導(dǎo)的。不僅如此，OPIDN還會造成患者認知功能障礙[5]。目前對OPIDN普遍采用大劑量B族維生素進行治療，但是療效并不確切，進來研究發(fā)現(xiàn)，腦苷肌肽可以通過提高神經(jīng)細胞的存活率在OPIDN的治療中發(fā)揮作用[6]。本研究就旨在探討腦苷肌肽注射液對有OPIDN大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血漿CANP、NTE的影響。從而為OPDIN的治療提供數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1 實驗動物 選擇一級雄性SD大鼠135只，月齡2.5～4個月，平均(3.1±0.6)個月，質(zhì)量(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物飼養(yǎng)中心提供。所有大鼠在研究期間均飼養(yǎng)與20～25℃條件下，給予普通顆粒飼料和自來水。

2 動物篩選 自制Y型電迷宮[7]，迷宮其中一臂作為起點，通電后會給予大鼠電刺激信號，另外兩臂中，一臂給予燈光信號指示，為安全區(qū)，一臂無燈光信號指示，為危險區(qū)，通電后也會給予大鼠電刺激信號。分別將所有大鼠置于起點，通電后大鼠直接跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。當(dāng)大鼠達到安全區(qū)域后，停留1 min鞏固大鼠記憶，而后熄滅燈光信號，開始下一次訓(xùn)練。所有大鼠每日接受10次相同訓(xùn)練，共連續(xù)進行7 d。第8天對大鼠進行篩選，大鼠重復(fù)相同的訓(xùn)練，10次中有9次及其以上給出正確反應(yīng)的大鼠入選研究。最終有132只大鼠入選研究。

3 動物模型制備 在所有入選的大鼠中，隨機挑選30只作為空白組。剩余102只大鼠接受樂果乳油造模，具體操作步驟如下：所有大鼠接受一次性腹腔注射樂果乳油300 mg/(kg·d)，以對其染毒。染毒后密切觀察大鼠的體態(tài)體征和健康狀況。急性期大鼠表現(xiàn)出站立不穩(wěn)、肌束顫動和呼吸急促，并出現(xiàn)越來越嚴(yán)重的肌無力現(xiàn)象。102只大鼠中有3只在中毒急性期死亡，繼續(xù)觀察剩余99只染毒大鼠。染毒2周后大鼠表現(xiàn)出伏地雙足距離增加，后腿無法支持軀干、后肢癱瘓等OPIDN癥狀。此時，對99只染毒大鼠按OPIDN癥狀進行分級：大鼠完全癱瘓為3級、后臀站立為2級、步態(tài)異常為1級、無體征為0級。選擇屬于2、3級的90只大鼠，將其隨機分為對照組、甲鈷胺組和聯(lián)合治療組，每組各30只。四組大鼠均入選后開始研究。

4 動物模型的藥物干預(yù) 甲鈷胺組大鼠開始研究后每日給予1.25 mg/(kg·d)甲鈷胺片劑，溶解在1 ml/kg蒸餾水中，灌胃給藥?？瞻捉M和對照組大鼠在開始研究后每日給予等量蒸餾水灌胃。聯(lián)合組大鼠給予與甲鈷胺組大鼠相同的灌胃治療，在此基礎(chǔ)上每日早晚兩次肌肉注射腦苷肌肽1.25 ml/(kg·d)。所有大鼠的干預(yù)周期均為4周。

5 動物模型藥物干預(yù)前后NTE和CANP的監(jiān)測與記憶能力測定 ①治療前、治療后2、4周大鼠血漿中NTE和CANP水平：分別在藥物干預(yù)前、治療后2、4周分別取5只大鼠，腹腔注射0.3 ml/(kg·d)的10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉后開胸取大鼠右心室血漿后處死，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中NTE和CANP水平；②治療4周后大鼠記憶再現(xiàn)能力測試：治療4周后給予所有剩余大鼠相同的Y型電迷宮和燈光信號指示，每只大鼠均連續(xù)測試10次，記錄大鼠出現(xiàn)正確反應(yīng)的次數(shù)。觀察兩組給藥大鼠在整個實驗過程中出現(xiàn)的生理和形態(tài)變化。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本研究各動物實驗組NTE和CANP水平和記憶再現(xiàn)能力和再現(xiàn)次數(shù)的前后差異比較。對四組大鼠的所有NTE和CANP水平采用方差分析進行處理，記憶再現(xiàn)正確反應(yīng)次數(shù)采用秩和檢驗。以P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同時間點大鼠血漿NTE蛋白水平 見表1。

表1 不同時間點大鼠血漿NTE蛋白水平(pg/ml)

染毒大鼠干預(yù)前血漿NTE蛋白水平顯著低于空白組大鼠(P<0.05)，甲鈷胺組和聯(lián)合組大鼠治療后血漿NTE水平上升(P<0.05)，其中聯(lián)合組大鼠治療后血漿NTE水平最高(P<0.05)。

2 不同時間點大鼠血漿CANP蛋白水平 見表2。染毒大鼠干預(yù)前血漿CANP蛋白水平顯著高于空白組大鼠(P<0.05)，甲鈷胺組和聯(lián)合組大鼠治療后血漿CANP水平下降(P<0.05)，其中聯(lián)合組大鼠治療后血漿CANP水平最低(P<0.05)。

表2 不同時間點大鼠血漿CANP蛋白水平(ng/ml)

3 大鼠記憶再現(xiàn)能力測試結(jié)果 見表3。染毒后的三組大鼠中，聯(lián)合組大鼠記憶再現(xiàn)能力最佳(P<0.05)。

表3 大鼠記憶再現(xiàn)能力測試結(jié)果

4 藥物不良反應(yīng) 兩組給藥大鼠給藥后均未出現(xiàn)明顯體態(tài)和生理變化。

討 論

有機磷作為一種神經(jīng)毒性藥物，在我國農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)中運用廣泛，近年來國家越發(fā)重視對有機磷中毒的研究。有機磷中毒患者不僅會出現(xiàn)中毒急性期癥狀，中毒2～3周以后還會出現(xiàn)OPIDN。OPIDN可以稱為有機磷中毒最嚴(yán)重的并發(fā)癥，且OPIDN的發(fā)生與單次有機磷暴露量無關(guān)，而與機體有機磷暴露總量有關(guān)，即使是多次小劑量的與有機磷接觸，患者不出現(xiàn)急性中毒的臨床癥狀，也有很大概率出現(xiàn)OPIDN[8]。目前臨床上對OPIDN的治療還沒有特效藥物，治療多采用大劑量B族維生素、三磷酸腺苷、地巴唑、高壓氧及針灸等營養(yǎng)神經(jīng)，改善周圍循環(huán)等治療方案，但療效不確切。本研究在目前臨床常用甲鈷胺的基礎(chǔ)上合用了腦苷肌肽注射液來對OPIDN大鼠進行治療。

從大鼠的記憶再現(xiàn)功能上來看，聯(lián)合治療的大鼠記憶再現(xiàn)功能顯著優(yōu)于甲鈷胺單獨治療大鼠。OPIDN大鼠的記憶再現(xiàn)功能較正常大鼠明顯下降，這應(yīng)當(dāng)與染毒大鼠腦部神經(jīng)細胞排列雜亂、稀疏有關(guān)，大鼠染毒后大量神經(jīng)元固縮變形，腦組織損傷嚴(yán)重[9]。腦苷肌肽是由健康家兔的肌肉提取物和牛腦的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物混合而成的注射液，含有多種游離氨基酸、多肽、核算和神經(jīng)節(jié)苷脂等成分。可以有效恢復(fù)神經(jīng)細胞的血氧供應(yīng)、提高血紅細胞的載氧能力，提高神經(jīng)元的存活能力和改善腦部微循環(huán)[10]。因此，進行過腦苷肌肽治療的大鼠記憶重現(xiàn)能力明顯優(yōu)于只進行了甲鈷胺治療的大鼠。

本研究還對血漿中兩種與OPIDN相關(guān)的蛋白水平進行了檢測。NTE是一種單鏈蛋白質(zhì)，研究顯示[11]，OPIDN的出現(xiàn)與機體內(nèi)NTE與有機磷(OP)結(jié)合后老化的有關(guān)。OP可以選擇性的與NTE結(jié)合，并通過后續(xù)老化過程來抑制NTE活性，且這種抑制是不可逆的，這也解釋了少量多次接觸有機磷藥物后機體依然會出現(xiàn)OPIDN的原因。OP首先與NTE的活性位點結(jié)合，接著OP的烷基側(cè)鏈脫落與NTE活性位點附近的另一區(qū)域結(jié)合，完成老化過程，研究表示[12]，當(dāng)70%以上的NTE被抑制時，將會出現(xiàn)OPIDN的臨床表現(xiàn)。本研究結(jié)果提示，染毒大鼠2周后血漿中NTE蛋白水平較空白組大鼠明顯下降，這是因為與OP結(jié)合后的老化的NET蛋白無法通過酶聯(lián)反應(yīng)被檢測出來，因此血漿中具有正常生理功能的NTE水平持續(xù)下降。當(dāng)OP選擇性的與NTE結(jié)合后，可造成酶末端發(fā)生一系列的生化變化，導(dǎo)致酶出現(xiàn)被稱為“衰老”的改變，兩者結(jié)合產(chǎn)生的物質(zhì)穩(wěn)定性高，不易水解。OP正是經(jīng)過這一過程來達到消耗具有生理活性的NTE的目的。大鼠接受甲鈷胺治療后NTE蛋白水平上升緩慢，而接受腦苷肌肽治療后，NTE的水平可穩(wěn)步上升。腦苷肌肽中具有生物活性的成分可能可以促進機體快速產(chǎn)生新的NTE來代替已經(jīng)老化失活的NTE，從而發(fā)揮生理作用。

CANP是一類需要環(huán)境中的Ca2+進行激活的中性半胱氨酸水解酶。在健康機體中，CANP發(fā)揮著降解膜蛋白、細胞骨架蛋白和各種信號傳遞酶的作用。在細胞的增殖、生長、分化、骨架重建和凋亡中都發(fā)揮著重要作用。已有研究顯示，CANP在多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起作用[13]。在本研究中，染毒大鼠2周后血漿中CANP蛋白水平較空白組大鼠顯著上升，由此說明，OPIDN的發(fā)生與CANP蛋白的過度活化有關(guān)。而CANP的活化需要環(huán)境中存在足夠濃度的Ca2+才能夠?qū)崿F(xiàn)。OPIDN患者神經(jīng)元遭到破壞，細胞膜通透性改變，胞漿中Ca2+大量入血，導(dǎo)致血漿內(nèi)CANP的活性出現(xiàn)變化。CANP的活化導(dǎo)致了神經(jīng)軸突末端的蛋白質(zhì)過度水解，導(dǎo)致神經(jīng)突觸間的信號傳導(dǎo)通路被破壞，進而導(dǎo)致OP中毒后生物體的多種神經(jīng)功能障礙和損傷?？梢酝茰y，腦苷肌肽的運用，可以修復(fù)受損的神經(jīng)細胞，重建細胞膜的屏障作用，促進神經(jīng)干細胞的分化和增殖，維持神經(jīng)代謝，恢復(fù)神經(jīng)組織功能。因此聯(lián)合治療組大鼠治療后血漿中CANP水平得以迅速下降。

綜上所述，腦苷肌肽注射液對于OPIDN大鼠的記憶能力和神經(jīng)細胞損傷修復(fù)均具有積極作用。

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