慢性腎功能衰竭大鼠腸道巨噬細胞結構及功能狀態(tài)研究*

王 萌，魏 萌，劉 華，蔣紅利

西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液凈化科(西安710061)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure，CRF)是各種慢性腎臟病進展的共同結局。微炎癥是終末期腎病常見的特征表現，與患者的不良預后相關[1]。我們前期研究發(fā)現，CRF大鼠及患者體內均存在腸道細菌移位，且與體內微炎癥狀態(tài)相關[2-3]。巨噬細胞在很多腎臟疾病的進展中起關鍵作用，并且是代謝性疾病初始和炎癥發(fā)生時的一個關鍵效應細胞[4]。多種疾病模型研究及體外實驗[5-7]均發(fā)現，腸道巨噬細胞或可參與腸道細菌移位，其功能狀態(tài)與細菌移位密切相關。尿毒癥時腸道巨噬細胞是耐受性的反應性低下還是被激活增強機體免疫反應或自身損傷？目前尚無研究報道。本實驗通過研究CRF大鼠腸道巨噬細胞的功能狀態(tài)及相關膜抗原的表達情況，進一步探討CRF狀態(tài)下細菌移位的發(fā)生機制。

材料與方法

1 材 料 動物：雄性SD大鼠，體重250～300 g，購于西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心，清潔環(huán)境中標準飼料及水喂養(yǎng)，自由飲食，適應性喂養(yǎng)1周?？贵w：鼠抗CD68單克隆抗體、兔抗Toll樣受體4(TLR4)多克隆抗體、兔抗核轉錄因子κB(NF-κB)單克隆抗體、鼠抗主要組織相容性復合體Ⅱ(MHC-Ⅱ)單克隆抗體購自英國Abcam公司；FITC標記山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗小鼠IgG、山羊抗小鼠IgG633、4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)購自北京中杉金橋有限公司。

2 實驗方法 ①模型制備與分組：模型組(n=25)采用經典5/6腎臟切除術造模，一期手術切除2/3體積的左腎，二期手術切除整個右腎，兩期手術間隔1周。假手術組(n=15)同樣行兩期手術，每次手術僅打開腎包膜，腎臟暴露同樣時間后逐層縫合。術后清潔環(huán)境喂養(yǎng)，不使用抗生素避免菌群變化，術后第1天禁食，不禁飲水，而后正常飲食。②標本采集：大鼠飼養(yǎng)10周后取材并處死。取血液進行尿素氮、肌酐檢測。取腎臟、近端空腸(以Treitz韌帶連接處后1 cm開始取材)、遠端回腸(回盲部回腸端上1 cm處開始取材)、橫結腸組織分別進行固定及凍存。標本采集過程嚴格無菌操作。

3 觀察項目 ①腎功能檢測：全自動生化分析儀測定，血尿素氮采用紫外速率比色法、血肌酐采用速率比色法。②光鏡組織病理學觀察：取出固定液中的腎臟、各腸段標本，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制成4～6 μm石蠟切片。分組行HE染色和馬松三色染色(Masson’s Trichrome Stains)。③電鏡組織超微結構觀察：新鮮腸道標本置于電子顯微鏡固定液中，委托西安交通大學醫(yī)學院電子顯微鏡室進行封閉固定，于層面中選取固有層巨噬細胞進行超微結構觀察。④雙重免疫熒光染色檢測腸巨噬細胞TLR4、NF-κB、MHC-Ⅱ表達：取各腸段組織制作冰凍切片，將模型組和假手術組冰凍切片分別分為陽性組(滴加抗體染色)及陰性對照組(滴加緩沖液對照)并標記?？贵w按比例加入緩沖液稀釋并搖勻備用。腸巨噬細胞TLR4表達：切片置PBS緩沖液清洗3次后甩干，滴加10%正常牛血清封閉液覆蓋，濕盒中室溫放置2 h；吸去封閉液，陽性組先后滴加稀釋后的一抗(鼠抗巨噬細胞CD68單克隆抗體和兔抗TLR4多克隆抗體)，陰性對照組滴加PBS緩沖液覆蓋，濕盒中4 ℃冰箱放置12 h；吸去一抗，PBS緩沖液清洗3次并甩干，避光條件下兩組均先后滴加稀釋后的二抗(山羊抗小鼠IgG633及FITC標記山羊抗兔IgG)，濕盒中室溫避光放置1 h；避光吸去二抗，PBS緩沖液清洗3次后甩干，避光滴加稀釋后的DAPI(多色核熒光染料)染液覆蓋，濕盒中室溫避光放置10 min；避光吸去DAPI染液，滴加防熒光淬滅封片劑，蓋玻片，濕盒中4℃避光保存。腸巨噬細胞NF-κB表達：操作同前，陽性組一抗為鼠抗巨噬細胞CD68單克隆抗體和兔抗NF-κB單克隆抗體。腸巨噬細胞MHC-Ⅱ表達：繼標記CD68單抗后，避光條件下陽性組滴加稀釋后的第二種一抗(鼠抗MHC-Ⅱ單克隆抗體)，陰性組滴加PBS緩沖液覆蓋，濕盒中4 ℃冰箱避光放置12 h；避光吸去一抗，PBS緩沖液清洗3次后甩干，兩組均避光滴加稀釋后的第二種二抗(FITC標記山羊抗鼠IgG)，濕盒中室溫避光放置1 h；后核染色步驟同前。⑤激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像：使用激光共聚焦顯微鏡，選擇合適的圖像分辨率(兩組對應腸段的對應抗體圖像采集使用相同分辨率以便對比熒光強度)進行組織掃描，得到各顏色熒光的圖像及合成圖像，保存圖像結果及對應標號，將所得圖像結果刻盤導出，采用image pro plus分析平均熒光吸光度。

結 果

1 腎功指標 見表1。模型組大鼠血清尿素氮、肌酐明顯高于假手術組大鼠，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 模型組與假手術組大鼠腎功能比較

注：與假手術組比較，*P<0.05

2 腎臟病理改變 見圖1。模型組腎小球局灶或彌漫性固縮、硬化、玻璃樣變，系膜及基質增生，腎間質纖維結締組織增生，大量炎性細胞浸潤；腸黏膜變細、倒塌，黏膜層炎性細胞浸潤，吸收細胞減少。假手術組大鼠腎臟及各腸段結構清晰，形態(tài)均勻，幾乎無炎性細胞浸潤。

3 腸道及巨噬細胞病理改變 見圖2。透射電鏡下，模型組大鼠腸微絨毛參差不齊，粗短或消失，腸上皮細胞間隙增大，胞間連接紊亂斷裂，有明顯的組織水腫，杯狀細胞減少；巨噬細胞體積增大，突起、偽足增多，形態(tài)不規(guī)則，呈現活化表現。假手術組腸微絨毛整齊排列，胞間連接結構清晰；巨噬細胞形態(tài)規(guī)則，表面突起、偽足少。

4 大鼠腸巨噬細胞TLR4、NF-κB、MHC-Ⅱ表達 見圖3～5。①模型組各腸段巨噬細胞特異性抗原CD68+(紅色熒光)和TLR4抗原(綠色熒光)數量及強度較假手術組明顯增多，組合熒光大部分呈黃色，兩組間以末段回腸差別最明顯。②模型組各腸段巨噬細胞特異性抗原CD68+(紅色熒光)和NF-kB(綠色熒光)數量及強度明顯高于假手術組，重合性好。模型組熒光集中于腸絨毛，假手術組多散在分布。③模型組各腸段巨噬細胞特異性抗原CD68+(紅色熒光)明顯高于假手術組，兩組均未見明顯的綠色熒光與紅色熒光重合。MHC-II抗體為鼠單克隆抗體，組織同源性高，故熒光染色背景顏色深，有較強的非特異性著色。

A～D假手術組：腎臟Masson染色×200、腎臟HE染色×400、上段空腸HE染色×200、末段回腸HE染色×400；

E～H模型組：腎臟Masson染色×200、腎臟HE染色×400、上段空腸HE染色×200、末段回腸HE染色×400

圖1 模型組及假手術組腎臟、腸道病理

A：假手術組大鼠末端回腸電鏡×30000；B：模型組大鼠末端回腸電鏡×30000； C：假手術組大鼠末端回腸電鏡×5000；D：模型組大鼠末端回腸電鏡×5000 圖2 模型組及假手術組腸道、巨噬細胞病理

A～D模型組；E～H假手術組 圖3 模型組及假手術組末端回腸TLR4表達

A～D模型組；E～H假手術組 圖4 模型組及假手術組末端回腸NF-κB表達

圖5 腸道巨噬細胞各抗原熒光平均吸光度

討 論

1 CRF與腸道改變 本研究通過腸道組織病理學檢查發(fā)現，CRF大鼠存在明顯腸道改變，小腸黏膜病變較結腸嚴重，末端回腸病變最明顯，推測細菌移位較多出現在回腸。Schmidt 等[8]發(fā)現，大鼠注入內毒素后大鼠遠端回腸壞死明顯，腸道屏障被破壞，而致細菌和內毒素易位。Ammori 等[9]研究發(fā)現急性重癥胰腺炎時，回腸黏膜改變最明顯。另有研究[10]顯示， 肝硬化大鼠回腸黏膜屏障功能損傷及炎癥損傷最為明顯，且與肝功能分級有關。本研究結果與報道一致，更加可以推斷CRF時細菌移位最常出現在回腸。本研究電鏡下發(fā)現CRF狀態(tài)腸上皮細胞間緊密連接消失及淋巴細胞浸潤，與MODS、敗血癥等嚴重全身炎癥反應時腸道間緊密連接消失的結論一致[11-13]，為CRF時腸道細菌、內毒素移位提供依據。

2 CRF大鼠腸道巨噬細胞功能狀態(tài) 腸道巨噬細胞是一個不容忽視的炎癥反應的積極參與者，主要定植于腸固有層。炎癥反應發(fā)生時，巨噬細胞被細菌的脂多糖成分激活，釋放多種細胞因子、ROS以及髓過氧化物酶(MPO)，直接吞噬細菌。TLRs是一種模式識別受體(PRRs)，在髓源性細胞(如單核巨噬細胞)中表達，能識別病原相關分子模式，誘發(fā)天然免疫，是參與LPS識別和跨膜信號轉導的關鍵。Meng等[14]發(fā)現腸上皮TLR4基因敲除的小鼠巨噬細胞對LPS無反應。NF-κB是先天防御系統最重要的組成部分。TLR識別細菌及其組分后，激活NF-κB相關細胞內信號轉導途徑，選擇性啟動多種促炎細胞因子及炎癥介質的表達[15]。主要組織相容性復合體(MHC)，又稱主組織相容性復合基因，其表達產物MHC分子直接參與抗原提呈細胞對內源性或外源性抗原的提呈。活化的巨噬細胞表達 MHC-II類抗原，與吞噬的抗原形成MHC-II/抗原復合物被致敏淋巴細胞雙重識別，激活機體的特異性細胞免疫。不表達MHC-II類抗原的巨噬細胞只有吞噬作用。本研究利用雙重免疫熒光染色標記腸道巨噬細胞及巨噬細胞上TLR4、NF-κB及MHC-II，發(fā)現模型組大鼠各腸段CD68+細胞數量均多于假手術組，且各對應腸段TLR4及NF-κB的表達均高于假手術組，在遠端回腸差異最明顯。而兩組均不表達MHC-II，考慮有如下可能原因：①CRF機體腸道腸桿菌異常增生導致腸道內毒素水平明顯升高，在LPS的持續(xù)刺激下，腸道巨噬細胞或可激活為超活化巨噬細胞，具有更強的吞噬能力，但無處理抗原能力，與電鏡中觀察到模型組末段回腸巨噬細胞突起及胞漿溶酶體明顯增多相一致；②CRF機體存在免疫缺陷，單核細胞在含內毒素的微環(huán)境中發(fā)育表型和功能將發(fā)生改變，表現為HLA-DR表達降低，導致MHC類分子轉錄合成減少，可以從基因角度解釋本實驗結果；③本實驗電鏡結果顯示，模型組大鼠末端回腸固有層有大量巨噬細胞、中性粒細胞浸潤，未見明顯的T細胞增殖，考慮巨噬細胞的抗原呈遞能力被抑制，從而未出現明顯的T細胞活化增殖，與免疫熒光結果一致。

綜上所述，本研究提示CRF時腸道巨噬細胞浸潤增多，識別病原體能力增強，通過有效識別、攝取細菌，激活NF-κB，可釋放多種細胞因子，但無明顯抗原呈遞能力，不會進一步引起T細胞活化增殖觸發(fā)機體細胞免疫。CRF大鼠腸道細菌可能經M細胞或細胞間緊密聯結通過受損的腸道屏障，激活腸道巨噬細胞同時促進機體微炎癥狀態(tài)，巨噬細胞吞噬細菌后或可成為細菌載體促進細菌移位。在體外巨噬細胞和致病菌種也能觀察到上述情況。推測CRF時可能是CRF機體微炎癥狀態(tài)持續(xù)存在的一項發(fā)生機制。我們推測巨噬細胞活化促進腸道細菌移位，并且可能扮演了載體的角色。

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