內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)誘發(fā)C57BL/6小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)腔微量注射方法的建立

馮 萌，錢 莊，李 萌，彭 航,3，張 婉,3，武淑芳，邱裕生

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710061；2. 第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)病研究中心，陜西西安 710061；3. 前沿科學(xué)與技術(shù)研究院，陜西西安 710054)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種累及整個關(guān)節(jié)內(nèi)組織，以原發(fā)性或繼發(fā)性關(guān)節(jié)軟骨變性破壞、骨重建、滑膜增生、肌肉攣縮及關(guān)節(jié)僵直畸形為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1-2]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，原發(fā)性O(shè)A患病率在美國65歲及以上人群中高達(dá)33.6%，且呈現(xiàn)出OA日益年輕化的趨勢。其中膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)的繼發(fā)性O(shè)A以創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎多見[3-4]，其與運(yùn)動損傷、機(jī)械載荷應(yīng)力異常、關(guān)節(jié)失穩(wěn)及先天性關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常、畸形等有關(guān)。患者后期常常伴有劇烈疼痛或關(guān)節(jié)畸形，給患者造成極大痛苦，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。因此，OA是運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急需解決的一大難題。

利用哺乳動物制備骨關(guān)節(jié)炎模型的方法相對成熟，如家兔，但在小鼠內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)(destabilization of medial meniscus, DMM)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎模型中[5]，由于種屬差異及C57BL/6鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)小，在內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)過程中存在關(guān)節(jié)囊損傷大、縫合不全、術(shù)后感染致小鼠死亡、造模不可靠等問題。現(xiàn)有研究缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)可靠的微創(chuàng)手術(shù)視頻資料[6-7]，且在OA模型中行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射存在可重復(fù)性差的問題[8]。本課題通過模擬關(guān)節(jié)腔注射OA疾病改善藥物來構(gòu)建一套標(biāo)準(zhǔn)操作流程，旨在提高轉(zhuǎn)基因小鼠DMM造模及關(guān)節(jié)腔微量注射的重復(fù)性和可靠性。

1 材料與方法

1.1動物喂養(yǎng)及動物福利本課題通過西安交通大學(xué)動物倫理委員會審批。24只雄性8周齡小鼠[9]購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量為(20±2)g，SPF級動物房溫度在25 ℃左右，晝夜交替規(guī)律(12 h∶12 h)，提供充足的飲食，每3 d更換木屑1次[10]。適應(yīng)性飼養(yǎng)后行DMM造模，術(shù)后確保小鼠麻醉蘇醒并存活，正常喂食進(jìn)水，每隔2 d補(bǔ)充1次飼料和水。根據(jù)西安交通大學(xué)實驗動物尸體處置操作規(guī)程，焚化處理動物尸體。

1.2主要實驗材料10 μL微量注射器(MicroliterTMSyringes, Hamilton Company, Nevada, USA)，燒杯(50 mL)，生理鹽水，甲苯胺藍(lán)，番紅O/固綠(西安化學(xué)試劑廠)。消毒用品為碘伏、無菌棉球等，顯微手術(shù)器械包括外科顯微鏡(重光COIC)及尼康D7100單反相機(jī)，有齒鑷、彎鉗、持針器、醫(yī)用縫合線(7-0)、手術(shù)刀柄及11P號尖刀片。實驗人員防護(hù)設(shè)施包括口罩、帽子、一次性手套、墊單及銳器收集盒。

1.3小鼠骨關(guān)節(jié)炎造模C57BL/6小鼠隨機(jī)分假手術(shù)組及DMM組(n=12)。麻醉使用50 g/L水合氯醛腹腔注射，術(shù)區(qū)剃毛，小鼠選取仰臥位固定左后肢屈膝90°，充分消毒術(shù)野。由圖1示，剪開皮膚暴露髕韌帶，用尖刀剪沿髕韌帶內(nèi)緣剖開關(guān)節(jié)囊，鈍性清理關(guān)節(jié)內(nèi)脂肪組織，內(nèi)側(cè)半月板通過內(nèi)側(cè)半月板脛副韌帶(MMTL)與脛骨平臺相連。離斷MMTL，沖洗創(chuàng)口后，7-0手術(shù)縫線縫合關(guān)節(jié)腔，關(guān)閉皮膚創(chuàng)口，局部外敷阿莫西林預(yù)防創(chuàng)口感染。假手術(shù)組僅剖開關(guān)節(jié)囊后逐層縫合。同時觀察小鼠麻醉蘇醒及傷口愈合情況。

圖1內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)誘發(fā)C57BL/6小鼠骨關(guān)節(jié)炎的操作圖

Fig.1 Destabilization of the medial meniscus to induce osteoarthritis model in C57BL/6 mice

A：切開皮膚；B：沿著髕韌帶(紅色箭頭示)切開關(guān)節(jié)囊；C：暴露內(nèi)側(cè)半月板，離斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶；D：將髕韌帶后脫位充分顯露小鼠膝關(guān)節(jié)腔解剖結(jié)構(gòu)，綠色箭頭示股骨髁，黑色箭頭示脛骨平臺，橙色箭頭示內(nèi)側(cè)半月板，實際DMM造模不做步驟D。

1.4國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)分級/分期評分系統(tǒng)小鼠頸椎脫位處死取出右膝關(guān)節(jié)，40 g/L多聚甲醛固定24～48 h，100 g/L EDTA脫鈣1周，石蠟包埋，每隔4 μm行冠狀位切片，行番紅O/固綠染色。雙人分開采用國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(Osteoarthritis Research Society International, OARSI)分級/分期系統(tǒng)，即OARSI分7級，OA軟骨病理損傷涉及范圍分5期(0期未見OA活動，1期<10%，2期為10%～25%，3期為25%～50%，4期>50%)，總病理評分=分級×分期[11]。

1.5骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)腔微量注射方法的建立12只DMM造模2周后小鼠隨機(jī)分2組(n=6)，實驗組關(guān)節(jié)腔注射甲苯胺藍(lán)，對照組為生理鹽水，頻率為1周/次。麻醉小鼠后備皮消毒，取膝關(guān)節(jié)正中縱向皮膚切口，長約2 mm，牽拉皮膚尋找膝關(guān)節(jié)髕韌帶，應(yīng)用微量注射器以髕韌帶內(nèi)緣中點為進(jìn)針點，斜向后上方約1.5 mm深度注射生理鹽水或甲苯胺藍(lán)入關(guān)節(jié)腔，拔針后稍用力加壓針眼處，最后縫合皮膚切口。

2 結(jié) 果

2.1DMM誘發(fā)C57BL/6小鼠膝不同區(qū)域軟骨組織的病理改變DMM術(shù)中膝關(guān)節(jié)出血少，經(jīng)觀察術(shù)后1 h左右小鼠逐漸復(fù)蘇并可自由活動，均未出現(xiàn)麻醉過量反應(yīng)。造模4周后行番紅O/固綠染色，以關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)分區(qū)，DMM組小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺表面軟骨不規(guī)則，番紅O著色減少，負(fù)重區(qū)軟骨侵蝕破壞達(dá)到鈣化軟骨層，約占內(nèi)側(cè)股骨髁軟骨表面的50%(圖2)。而DMM組內(nèi)側(cè)股骨髁軟骨破壞相對較淺，外側(cè)股骨髁及脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨顯示基本正常。假手術(shù)組和DMM組相比較，關(guān)節(jié)4個區(qū)域的軟骨相對完整，無番紅著色缺失，未見骨贅形成及滑膜增生。

圖2小鼠膝關(guān)節(jié)不同解剖區(qū)域骨關(guān)節(jié)炎的病理改變

Fig.2 Site-specific staining of knee joint sections from DMM-induced osteoarthritis model in mice

番紅O/固綠染色，A、C：bar=500 μm；B、D：bar=125 μm。

2.2OARSI分級/分期系統(tǒng)評定小鼠OA軟骨病理的程度由于膝內(nèi)側(cè)解剖區(qū)域的軟骨OA病理改變顯著，在 OARSI評分表現(xiàn)為DMM組股骨內(nèi)側(cè)髁(MFC)評分為3.417±0.642 1(n=12)，內(nèi)側(cè)脛骨平臺(MTP)評分為9.583 0±0.811 5(n=12)，二者行配對雙尾t檢驗，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.000 1)，說明脛骨平臺OARSI病理評分較股骨髁評分高(圖3)。假手術(shù)組MFC評分結(jié)果為0.416 7±0.148 6(n=12)，MTP評分為 0.583 3±0.148 6(n=12)，t檢驗二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.503 5)。而DMM組和假手術(shù)組的MFC及MTP評分分別利用獨立樣本t檢驗比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000 2，P<0.000 1)。

2.3甲苯胺藍(lán)使軟骨著色驗證了關(guān)節(jié)腔微量注射技術(shù)可靠由圖4可見，DMM術(shù)后關(guān)節(jié)囊愈合良好，注射生理鹽水組的膝關(guān)節(jié)(圖4A、4B)不能使關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨著色。圖4C、圖4D示，成功注射甲苯胺藍(lán)則關(guān)節(jié)腔充盈，切開關(guān)節(jié)囊后軟骨組織明顯藍(lán)染。此外，發(fā)現(xiàn)成年OA小鼠關(guān)節(jié)腔容積在6～10 μL，若給藥劑量過大因關(guān)節(jié)腔張力過高易發(fā)生滲漏現(xiàn)象。

圖3C57BL/6小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎病理組織的OARSI評分

Fig.3 Histological assessment of knee joint in C57BL/6 mice based on OARSI score system

3 討 論

由于C57BL/6小鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)小，關(guān)節(jié)軟骨厚度約30 μm[12]，小鼠關(guān)節(jié)腔微量給藥及注射劑量可供參考文獻(xiàn)少，初學(xué)者較難掌握DMM及微量注射技術(shù)。

圖4小鼠關(guān)節(jié)腔微量注射的操作圖

Fig.4 Representative images showed the procedure of joint cavity micro-aspiration in mice

A、C：斜后上方進(jìn)針，注射生理鹽水/甲苯胺藍(lán)后壓迫2 min，針眼無液體滲出；B、D：處死小鼠后切斷前后交叉韌帶，充分暴露關(guān)節(jié)面。紅色箭頭示髕韌帶，黑色箭頭示脛骨上段，橙色箭頭示股骨髁。

在研究基因敲除小鼠OA模型中，關(guān)節(jié)腔注射給藥技術(shù)的可重復(fù)性決定最終實驗結(jié)果的可信性。GLASSON等[5]曾報道129/SvEv小鼠OA造模，但轉(zhuǎn)基因背景小鼠價格昂貴，獲得困難且小鼠品系種屬存在差異。本組實驗通過DMM誘發(fā)制備C57BL/6雄性小鼠OA模型，在此基礎(chǔ)上建立膝關(guān)節(jié)腔注射微量給藥方法，該可視化、一站式微創(chuàng)操作流程效果可靠，有助于微量注射技術(shù)在轉(zhuǎn)基因小鼠OA模型中的應(yīng)用，指導(dǎo)關(guān)節(jié)腔注射OA疾病改善藥物的方法來治療OA[13-14]。因此，本課題建立的微量注射方法具有重要實際應(yīng)用價值。

其次，與大鼠常用的前交叉韌帶切斷術(shù)、家兔中應(yīng)用木瓜蛋白酶聯(lián)合前交叉韌帶切斷術(shù)制備持續(xù)進(jìn)展OA模型操作不同[15]，小鼠OA模型制備為顯微操作[8]。本課題為初學(xué)人員提供了手術(shù)圖像資料，有助于在熟悉關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)并保護(hù)其完整的前提下，降低關(guān)節(jié)囊損傷，節(jié)約轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量，避免關(guān)節(jié)縫合不全、術(shù)后感染等問題。目前，OA的診治和軟骨修復(fù)一直是臨床和基礎(chǔ)研究的難題[1,16]，利用動物實驗建立正常組、假手術(shù)組及DMM誘發(fā)OA模型組，從分子機(jī)制去理解OA病理進(jìn)展過程[6-7,13,17]，可為OA的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

不同于Mankin評分系統(tǒng)，OARSI分級/分期評分在評估C57BL/6小鼠的OA早期病理改變，可信度較高[11]，推薦版的OARSI半定量分級評分針對小鼠膝關(guān)節(jié)冠狀位切片按解剖區(qū)域評估軟骨病理，更易掌握[12]。本課題中DMM組C57BL/6小鼠內(nèi)側(cè)股骨髁及脛骨平臺OA進(jìn)展相對較重，負(fù)重較大的脛骨平臺軟骨侵蝕最突出，表現(xiàn)為OASRI評分增高，與GLASSON等[5]文獻(xiàn)報道一致。此外，通過OA小鼠膝關(guān)節(jié)腔注射，發(fā)現(xiàn)第2周時關(guān)節(jié)腔的創(chuàng)口已良好愈合。與單次關(guān)節(jié)腔注射不同[6]，在OA小鼠膝關(guān)節(jié)中多次隔周重復(fù)注射，關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)可保持完整，并發(fā)現(xiàn)OA關(guān)節(jié)腔的容積在6～10 μL之間，這對關(guān)節(jié)腔注射給藥劑量的確定具有參考價值。

總之，本研究為各專業(yè)背景人員從理論和操作上建立了一站式圖文操作流程，有利于推進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠OA造模及關(guān)節(jié)腔注射給藥的規(guī)范化。

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