結(jié)核分枝桿菌PPE36蛋白增加恥垢分枝桿菌在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)生存及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌

梁麗娟，米友軍，周明方，王雪林

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；3. 蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅蘭州 730000)

結(jié)核分枝桿菌每年導(dǎo)致900萬人感染，200萬人死亡。近年來，由于HIV共感染結(jié)核、耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病出現(xiàn)復(fù)燃[1]。因此，研究結(jié)核發(fā)病機(jī)制對于預(yù)防、治療結(jié)核病至關(guān)重要。

PE/PPE蛋白家族共有168個成員，其中PPE蛋白有69個。PPE家族在N端含有保守的110～180個氨基酸殘基，C端序列和大小是可變的。PPE的命名是根據(jù)N端含有的脯氨酸(P)-脯氨酸(P)-谷氨酸(E)殘基而來。許多PPE蛋白已被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)功能并被認(rèn)為是分枝桿菌毒力因素[2]。在感染發(fā)生時PPE蛋白能夠影響多種細(xì)胞功能及免疫反應(yīng)[3]：①PE/PPE蛋白通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)增加分枝桿菌生存，PPE25同源的海分枝桿菌蛋白影響吞噬體-溶酶體的融合[4]。②PPE蛋白可增加細(xì)胞壞死，毒力分枝桿菌能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞壞死，增加胞內(nèi)生存與擴(kuò)散，PE25/PPE41復(fù)合體可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。③PPE蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞因子反應(yīng)，PPE2抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NO 的生成[5]，PPE38可誘導(dǎo)TNF-α及IL-6的產(chǎn)生[6]。

PPE36屬于PE/PPE蛋白家族成員。VOSKUIL等[7]研究表明PPE36在不同壓力情況下呈現(xiàn)變化的表達(dá)模式。另外，在非致病性的恥垢分枝桿菌中不含有PPE36同源基因，表明PPE蛋白在結(jié)核分枝桿菌致病性方面起重要的作用。目前對于PPE36蛋白免疫調(diào)節(jié)作用尚無報(bào)道。因此，本研究將PPE36構(gòu)建入恥垢分枝桿菌，通過研究重組菌生長曲線，重組菌對小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)生存、巨噬細(xì)胞活力及細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，探討PPE36在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1材料鼠ANA-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640(Hyclone，美國)完全培養(yǎng)基中[含100 mL/L胎牛血清(FCS；Hyclone)、100 U/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素(Hyclone)]，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中。大腸桿菌DH5α(康為世紀(jì)，中國)培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基中用于DNA克隆。恥垢分枝桿菌MC2155及重組恥垢分枝桿菌培養(yǎng)于Middlebrook 7H9(MB7H9，Difco，美國)液體培養(yǎng)基(含5 mL/L甘油、0.5 mL/L Tween80、0.85 g/L NaCl、2 g/L葡萄糖、2 g/L BSA)。根據(jù)需要添加25 μg/mL卡拉霉素。

1.2方法

1.2.1PPE36重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv為模板擴(kuò)增ppe36基因，首先以正向引物5′-TTACTAGTCACCATCACCCCAATTT-CTG-3′(酶切位點(diǎn)SpeⅠ)、反向引物5′-CCGTAAGCTTTCAAAACTTAGGATGTTCC-3′(酶切位點(diǎn)HindⅢ)擴(kuò)增出含3個his密碼子的ppe36(732 bp)片段，將該片段插入克隆載體。繼續(xù)以正向引物5′-TGAATTCATGCATCACCATCACCATCACCCCA-3′(酶切位點(diǎn)EcoRⅠ)，反向引物同上，擴(kuò)增出含6個his的ppe36。將該片段雙酶切后插入質(zhì)粒pMV261，構(gòu)建pMV261-his6-ppe36重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒及pMV261空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌MC2155(MS)中，分別命名為MS-PPE36、MS-vec。用含25 μg/mL卡拉霉素的M7H10平板篩選MS-PPE36、MS-vec重組恥垢分枝桿菌。重組菌培養(yǎng)至OD值為0.8～1.0，收集細(xì)菌超聲破碎后行SDS-PAGE電泳，Western blot檢測PPE36蛋白表達(dá)。

1.2.2重組菌生長曲線 將MS-vec、MS-PPE36重組菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用含0.5 mL/L Tween80的PBS洗2次，PBS重懸，將菌液反復(fù)5次通過帶27G注射器針頭的注射器，制成單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液，測定A580。分別接種于MB7H9液體培養(yǎng)基中(含25 μg/mL卡那霉素)，調(diào)整菌液初始吸光度(A580)值為0.02，同時放入滅菌的玻璃珠，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取培養(yǎng)物100 μL測定吸光度(A600)值，直至60 h，繪制成生長曲線。

1.2.3MS-PPE36感染的ANA-1巨噬細(xì)胞 ANA-1巨噬細(xì)胞按照5×105/mL接種于含RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。重組菌培養(yǎng)于含25 U/mL卡拉霉素的培養(yǎng)基至對數(shù)生長期，收集細(xì)菌后，RPMI-1640中制備單細(xì)胞懸液。按照MOI=10∶1(細(xì)菌∶巨噬細(xì)胞)于不含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行感染，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。感染后用溫?zé)岬腞PMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)于含40 mL/L FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2.4重組菌胞內(nèi)生存能力分析 分別于感染后6、24、48 h收集感染細(xì)胞，用溫?zé)岬腜BS洗2次，用含0.05 g/L SDS的PBS液1 mL裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后用含0.5 g/L Tween80的PBS倍比稀釋，將稀釋液體鋪于含25 mg/mL卡拉霉素的平板上。3～5 d之后觀察菌落形成單位(CFUs)。

1.2.5乳酸脫氫酶(LDH)釋放 用MS-vec、MS-PPE36分別感染ANA-1巨噬細(xì)胞，于感染后6、24、48 h收集上清液，利用LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega，美國)檢測LDH活性，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。LDH釋放百分比=100×(實(shí)驗(yàn)組LDH釋放量-自發(fā)LDH釋放)/(LDH最大釋放量-自發(fā)LDH釋放量)。自發(fā)LDH釋放量為未感染細(xì)胞自發(fā)釋放，LDH最大釋放量為未感染的細(xì)胞完全裂解后釋放的LDH。

1.2.6細(xì)胞因子檢測 用MS-vec、MS-PPE36分別感染ANA-1巨噬細(xì)胞，分別于6、24、48 h收集上清液，4 ℃、500×g離心5 min收集上清。ELISA檢測試劑盒(ebioscience，美國)檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-4表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析。生長曲線用log-rank檢驗(yàn)，細(xì)胞活力、重組菌胞內(nèi)持留采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)，同時進(jìn)行線性趨勢分析。細(xì)胞因子組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MS-PPE36重組菌的構(gòu)建從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組擴(kuò)增出ppe36基因(圖1A)。利用分子克隆的方法產(chǎn)生攜帶6個His標(biāo)簽的pMV261-ppe36重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入MS，利用鼠抗His抗體通過Western blot鑒定PPE36蛋白的表達(dá)(27.5 ku，圖1B)。

圖1ppe36PCR擴(kuò)增及PPE36在恥垢分枝桿菌表達(dá)Westernblot鑒定

Fig.1ppe36 gene was amplified from H37Rv and PPE36 was expressed in MS

A,M：marker；1：ppe36；B,M：marker；1：MS-PPE36；2：MS-vec。

2.2PPE36對MS生長曲線的影響由圖2可見MS-vec、MS-PPE36培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，48 h后進(jìn)入平臺期，盡管在生長曲線略有不同，但兩組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明MS表達(dá)PPE36蛋白之后，細(xì)菌的生長并未受到影響。

為檢測PPE36在調(diào)節(jié)宿主-病原體相互作用中的作用，將ppe36構(gòu)建入穿梭質(zhì)粒pMV261，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入MS。通過比較MS-vec、MS-PPE36生長曲線，可見過量表達(dá)PPE36并不能導(dǎo)致體外生長的缺陷。

2.3PPE36對巨噬細(xì)胞活力的影響利用重組菌感染ANA-1，通過檢測培養(yǎng)上清中LDH釋放水平來量化巨噬細(xì)胞裂解程度。感染6 h后，MS-PPE36組LDH釋放量顯著增加，48 h時達(dá)到37%，而對照組只有30%(圖3)。結(jié)果表明，MS表達(dá)PPE36之后可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞裂解。

2.4PPE36對MS在巨噬細(xì)胞內(nèi)的持留的影響為研究蛋白在分枝桿菌胞內(nèi)持留所發(fā)揮的作用，建立重組MS感染ANA-1巨噬細(xì)胞模型。在各個時間點(diǎn)，MS-PPE36胞內(nèi)細(xì)菌載量明顯高于MS-vec(圖4)。由于起始感染量一致，生長曲線兩組間并沒有差異，表明表達(dá)PPE36之后能夠增加MS在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的持留。

圖2重組MS生長曲線

Fig.2 The growth curve of recombinant MS strains

圖3重組MS對巨噬細(xì)胞死亡的影響

Fig.3 Assay of cell death in macrophages infected with recombinant MS strains

與MS-vec組比較，**P<0.01。

圖4重組MS在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力

Fig.4 Survival of MS-Vec and MS-PPE36 in mouse macrophages

與MS-vec組比較，**P<0.01。

2.5PPE36對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響檢測調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)命運(yùn)的相關(guān)細(xì)胞因子[8]：TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4，表明PPE36能夠顯著增加細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，而降低IL-6的表達(dá)，IL-4、IL-10兩組間無差異(圖5)，IL-12未檢測到。結(jié)果說明PPE36能夠調(diào)節(jié)炎癥因子的平衡從而影響感染的后果。

圖5 重組MS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)Fig．5Productionofcytokinesbymacro?phagesinfectedwithrecombinantMSstrains與MS?vec組比較，??P<0．01。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌感染依然是發(fā)展中國家居民健康的主要威脅之一，因此對于結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的了解至關(guān)重要。近年來PE/PPE蛋白引起了大家的關(guān)注，許多PPE蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能已被研究[9]。PPE36是PE/PPE家族的成員，目前并沒有其功能學(xué)的相關(guān)研究。

以往研究發(fā)現(xiàn)，一些PPE蛋白如PPE25、PPE26能夠增加MS在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力[10]，本研究證實(shí)MS表達(dá)PPE36后同樣能夠增加其在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存，表明該蛋白在細(xì)菌持留方面具有一定的潛力。結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞后可抑制凋亡，同時誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，從而有利于逃避巨噬細(xì)胞的殺傷，有益于病原菌的擴(kuò)散[11]。TUNDUP等[12]研究發(fā)現(xiàn)PE25/PPE41能夠誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，利于細(xì)菌在宿主內(nèi)生存和繁殖。感染MS-PPE36之后，巨噬細(xì)胞壞死增加、活力減少。表明PPE36能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞壞死，具有輔助細(xì)菌逃避宿主細(xì)胞免疫殺傷，同時有利于細(xì)菌在體內(nèi)的播散。

分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后能夠誘發(fā)胞內(nèi)反應(yīng)，包括細(xì)胞因子和化學(xué)因子的產(chǎn)生[13]，這些因子能夠影響感染的結(jié)果[14]。巨噬細(xì)胞感染MS-PPE36后，能夠提高促炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)及降低抗炎因子IL-6的表達(dá)。促炎和抗炎成分在人體內(nèi)是不斷變化的。Th1細(xì)胞分泌高水平的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-12等促進(jìn)細(xì)胞殺傷胞內(nèi)病原體[15]；IL-6、IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，有利于病原體的生存[16]。IL-10抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時作為早期分枝桿菌清除的抑制劑[17]。盡管PPE36增加了促炎因子的水平，但MS-PPE36在胞內(nèi)生存能力增加。說明PPE36通過影響細(xì)胞內(nèi)其他反應(yīng)從而影響感染的結(jié)局。

總之，本研究在一定程度上擴(kuò)展了對于PPE蛋白的認(rèn)識，對于開發(fā)結(jié)核相關(guān)疫苗及設(shè)計(jì)治療策略具有現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] WHO, Global tuberculosis report 2016[M]. 2016.

[2] AHMED A, DAS A, MUKHOPADHYAY S. Immunoregulatory functions and expression patterns of PE/PPE family members: Roles in pathogenicity and impact on anti-tuberculosis vaccine and drug design[J]. IUBMB Life, 2015, 67(6):414-427.

[3] FISHBEIN S, VAN WYK N, WARREN RM, et al. Phylogeny to function: PE/PPE protein evolution and impact on Mycobacterium tuberculosis pathogenicity[J]. Mol Microbiol, 2015. 96(5):901-916.

[4] MCNAMARA M, DANELISHVILI L, BERMUDEZ LE. The Mycobacterium avium ESX-5 PPE protein, PPE25-MAV, interacts with an ESAT-6 family Protein, MAV-2921, and localizes to the bacterial surface[J]. Microb Pathog, 2012, 52(4):227-238.

[5] BHAT KH, DAS A, SRIKANTAM A, et al. PPE2 protein of Mycobacterium tuberculosis may inhibit nitric oxide in activated macrophages[J]. Ann N Y Acad Sci, 2013, 1283:97-101.

[6] DONG D, WANG D, LI M, et al. PPE38 modulates the innate immune response and is required for Mycobacterium marinum virulence[J]. Infect Immun, 2012, 80(1):43-54.

[7] VOSKUIL MI, SCHNAPPINGER D, RUTHERFORD R, et al. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis PE/PPE genes[J]. Tuberculosis (Edinb), 2004, 3(4):256-262.

[8] FLYNN JL, CHAN J. Immunology of tuberculosis[J]. Annu Rev Immunol, 2001, 19:93-129.

[9] MUKHOPADHYAY S, BALAJI KN. The PE and PPE proteins of Mycobacterium tuberculosis[J]. Tuberculosis, 2011, 91(5):441-447.

[10] MI Y, BAO L, GU D, et al. Mycobacterium tuberculosis PPE25 and PPE26 proteins expressed in Mycobacterium smegmatis modulate cytokine secretion in mouse macrophages and enhance mycobacterial survival[J]. Res Microbiol, 2016, 168(3):234-243.

[11] BEHAR SM, DIVANGAHI M, REMOLD HG. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: Is death an exit strategy?[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(9):668-674.

[12] TUNDUP S, MOHAREER K, HASNAIN SE. Mycobacterium tuberculosis PE25/PPE41 protein complex induces necrosis in macrophages: Role in virulence and disease reactivation?[J]. FEBS Open Bio, 2014, 4:822-828.

[13] HICKMAN SP, CHAN J, SALGAME P. Mycobacterium tuberculosis induces differential cytokine production from dendritic cells and macrophages with divergent effects on naive T cell polarization[J]. J Immunol, 2002, 168(9):4636-4642.

[14] SWEENEY KA, DAO DN, GOLDBERG MF, et al. A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis[J]. Nat Med, 2011, 17(10):1261-1268.

[15] DINARELLO CA. Proinflammatory cytokines[J]. Chest, 2000, 118(2):503-508.

[16] OPAL SM, DePALO VA. Anti-inflammatory cytokines[J]. Chest, 2000, 117(4):1162-1172.

[17] MURRAY PJ, YOUNG RA. Increased antimycobacterial immunity in interleukin-10-deficient mice[J]. Infect Immun, 1999, 67(6):3087-3095.