鹽酸法舒地爾對脂多糖誘導的大鼠血管內(nèi)皮功能障礙的影響

王 丹，盧迎宏，翟關群，王夢超，員小利，井海云

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院：1. 心血管內(nèi)科五病區(qū)；2. 心血管內(nèi)科一病區(qū)，河南鄭州 450052)

血管內(nèi)皮細胞是一種單層多角形或扁平細胞，分布在血管腔內(nèi)表面，多種血管活性物質(zhì)長期與血管內(nèi)皮細胞接觸，可影響其功能[1]。既往研究顯示，多種疾病與血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂具有十分緊密的關系，如高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病、腦梗死等，其中動脈粥樣硬化作為一種慢性炎癥反應過程，血管內(nèi)皮細胞是首先受損傷的細胞之一[2-3]。脂多糖(LPS)是一種強烈的炎癥啟動因子，可導致全身炎癥反應的發(fā)生，直接或間接激活并損傷內(nèi)皮細胞，導致內(nèi)皮細胞凋亡、通透性增加、細胞骨架重排等，最終改變血管內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能，引發(fā)內(nèi)皮細胞功能障礙，發(fā)生動脈粥樣硬化[4]。研究顯示，Rho A/Rho激酶(ROCK)信號通路參與了LPS誘導的動脈粥樣硬化過程[5]。作為唯一一種在臨床上應用的Rho激酶抑制劑，鹽酸法舒地爾(HF)具有抗動脈粥樣硬化的作用，但其是否具有改善血管內(nèi)皮功能障礙的作用,相關報道還十分有限。鑒于此，本研究通過構建LPS誘導的血管內(nèi)皮功能障礙大鼠模型，分析HF對血管內(nèi)皮功能障礙的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購于上海實驗動物中心。采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為：正常對照組、模型組和實驗A組、實驗B組，每組20只。

1.2主要試劑HF注射液(山西普德藥業(yè)股份有限公司)；LPS(美國Sigma公司)；全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Western一抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)；Western 二抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)；Cx43一抗、Cav-1一抗、eNOS一抗、RhoA一抗和ROCK1一抗(美國Epitomics公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記的二抗(江蘇碧云天公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)；精密電子天平(Mettler Toled公司)；紫外分光光度計(Nano Drop公司)；酶標儀(Thermo公司)；RT-PCR儀(Biometra 公司)；雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4動物模型的構建及干預參考文獻[6]方法，實驗A組、實驗B組和模型組尾靜脈注射LPS(1 mg/kg)建立大鼠內(nèi)皮功能障礙模型。0.5 h后，實驗A組和實驗B組分別腹腔注射10 mg/kg和30 mg/kg HF，模型組和對照組分別注射等量9 g/L生理鹽水。連續(xù)4周，每天按上述方法注射1次。

1.5取材麻醉(100 g/L水合氯醛)后處死各組大鼠，大鼠取仰臥位固定于超凈工作臺內(nèi)，剪下大鼠的胸主動脈，去除血管表面的結締組織和脂肪組織，用雙蒸水充分洗凈血管內(nèi)血液，一部分儲存于-80 ℃冰箱中，一部分多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋。

1.6TUNEL法檢測細胞凋亡取石蠟包埋主動脈組織，冰凍切片采用TUNEL進行細胞凋亡檢測，嚴格按TUNEL檢測試劑盒說明書操作。顯微鏡下紅色熒光為TUNEL陽性細胞，隨機選取6個不重復高倍視野(×200)，計算陽性細胞凋亡指數(shù)(AI)。計算公式為：AI=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.7RT-PCR檢測Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA和ROCK1的mRNA表達取-80 ℃主動脈組織，Trizol法分別提取各組總RNA?？俁NA采用純化柱純化。逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，引物設計：β-actin上游引物，5′-AGGCATCCTGACCCTGAAGTA-3′，下游引物，5′-GAGGCATACAGGGACAACACAG-3′；Cx43上游引物，5′-GCTCCACTCTCGCCTATGTC-3′，下游引物，5′-TAGTTCGCCCAGTTTTGCTC-3′；Cav-1上游引物，5′-CGCCATTCTCTTTCCTGC-3′，下游引物，5′-AGACGGTGTGGACGTAGA-3′；eNOS上游引物，5′-CTGCGGGTACGAAGGTATCG-3′，下游引物，5′-AGCATCCAATCCATCCAGCA-3′；RhoA上游引物，5′-GATGGAGCTTGTGGTAAGA-3′，下游引物，5′-AAACTATCAGGGCTGTCG-3′；ROCK1上游引物，5′-GGTGATGGCTATTATGGACG-3′，下游引物，5′-GTGTCTCGGAGCGTTTCC-3′。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應用RT-PCR檢測Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA和ROCK1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以β-actin作為內(nèi)參照，同一標本的β-actin產(chǎn)物表達水平校正各自目的基因的表達水平，相對表達水平=目的基因表達水平/β-actin表達水平。

1.8Westernblot檢測Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA和ROCK1蛋白表達取-80 ℃主動脈組織，用預冷的組織裂解液提取總蛋白，Bradford法測定樣品的蛋白含量，120 g/L的凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V 1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA和ROCK1單克隆抗體(1∶1 000)過夜結合，洗膜后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用 Quantity One 軟件進行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1各組大鼠的細胞凋亡情況模型組、實驗A組和實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)；實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著低于實驗A組(P<0.05，圖1)。

2.2各組大鼠Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA、ROCK1mRNA的表達水平模型組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，eNOS mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組Cx43、Cav-1、RhoA、ROCK1和eNOS mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1 mRNA表達水平顯著低于模型組(P<0.05)，eNOS mRNA表達水平顯著高于模型組(P<0.05)；實驗B組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1 mRNA表達水平顯著低于實驗A組(P<0.05)，eNOS mRNA表達水平顯著高于實驗A組(P<0.05，圖2)。

圖1各組大鼠內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)

Fig.1 Apoptosis index of endothelial cells in each group

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與實驗A組比較，#P<0.05。

圖2各組大鼠Cx43、Cav-1、RhoA、ROCK1和eNOSmRNA表達水平

Fig.2 mRNA expressions of Cx43, Cav-1, RhoA, ROCK1 and eNOS in each group

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與實驗A組比較，#P<0.05。

2.3各組大鼠Cx43、Cav-1、RhoA、ROCK1和eNOS蛋白的表達水平模型組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，模型組、實驗A組和實驗B組eNOS蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1蛋白表達水平顯著低于模型組(P<0.05)，eNOS蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)；實驗B組Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1蛋白表達水平顯著低于實驗A組(P<0.05)，eNOS 蛋白表達水平顯著高于實驗A組(P<0.05，圖3、圖4)。

3 討 論

血管內(nèi)皮損傷和功能障礙在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，因此，改善血管內(nèi)皮功能障礙對于降低心血管疾病發(fā)病率和死亡率具有重要意義[7]。LPS是革蘭氏陰性桿菌外膜上的一種糖蛋白，是一種炎癥啟動因子，可導致全身炎癥反應[8]。研究表明，血管內(nèi)皮細胞是LPS重要的效應細胞，LPS作用后可直接導致血管內(nèi)皮細胞膜通透性增加，進而形成血管內(nèi)皮損傷和功能障礙[9]。因此，LPS是建立血管內(nèi)皮損傷和功能障礙動物模型的常用藥物。

圖3Westernblott結果圖

Fig.3 Western blot results

1：模型組；2：實驗B組；3：對照組；4：實驗A組。

圖4各組大鼠Cx43、Cav-1、eNOS、RhoA和ROCK1蛋白表達水平

Fig.4 The protein expression levels of Cx43, Cav-1, eNOS, RhoA and ROCK1 in each group

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與實驗A組比較，#P<0.05。

本研究采用LPS誘導建立血管內(nèi)皮損傷和功能障礙大鼠模型，采用HF進行干預。數(shù)據(jù)顯示，模型組、實驗A組和實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)；實驗B組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著低于實驗A組(P<0.05)，表明LPS成功誘導建立了血管內(nèi)皮損傷和功能障礙大鼠模型，HF干預后有助于減少內(nèi)皮細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導通路被證實在動脈粥樣硬化過程中起重要作用，RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導通過引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙和氧化應激發(fā)生，促進細胞凋亡[10]。ROCK是小G蛋白RhoA的主要效應因子，其表達水平上調(diào)可促進氧化應激、炎癥反應和細胞纖維化，其表達水平降低可介導肌動蛋白重組、血管平滑肌細胞收縮和細胞粘附等多種生理功能[11]。ROCK參與內(nèi)皮細胞功能障礙的調(diào)節(jié)過程，在動脈粥樣硬化和細胞、器官損傷中起重要作用[12]。HF是一種Rho激酶抑制劑和細胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可顯著抑制RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導通路，降低ROCK1表達水平，減輕其對血管內(nèi)皮功能的損傷程度，降低血管內(nèi)皮細胞凋亡程度[13]。實驗表明，HF作用于LPS誘導的血管內(nèi)皮功能障礙大鼠模型，Cx43、Cav-1、RhoA和ROCK1 mRNA和蛋白水平顯著下降。Cx43是縫隙連接蛋白家族中的重要成員，主要由血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞表達，其在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中表達明顯上調(diào)[14]。Cav-1是一種小窩蛋白，廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞中，在動脈粥樣硬化早期可能參與低密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運和炎癥反應過程[15]。因此，HF可能通過RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導通路，抑制RhoA和ROCK1的表達，從而抑制Cx43、Cav-1的表達，發(fā)揮抗凋亡效應。

一氧化氮也參與了血管衰老過程，其主要由一氧化氮合成酶合成，其中eNOS是一氧化氮合成酶三種類型中的一種。本組數(shù)據(jù)顯示，模型組、實驗A組和實驗B組eNOS 蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；實驗A組和實驗B組eNOS蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)；實驗B組eNOS蛋白表達水平顯著高于實驗A組(P<0.05)，表明HF可提高eNOS表達水平，發(fā)揮對血管內(nèi)皮的保護作用。研究證實，Cav-1與eNOS蛋白存在一定的相互作用，Cav-1對eNOS有負性調(diào)節(jié)作用，其表達水平上升，可降低eNOS表達水平，導致血管內(nèi)皮功能障礙[16]。因此，HF對血管內(nèi)皮功能障礙的改善作用途徑之間可能存在一定的交叉作用。

綜上所述，HF可能通過RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導通路，抑制RhoA和ROCK1的表達，從而抑制Cx43、Cav-1的表達；可能通過提高eNOS表達水平，發(fā)揮改善血管內(nèi)皮功能障礙的功能。

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