miRNA-21通過TPM1參與高糖誘導的人主動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化與增殖

賈 珊，劉曉喚，馬維冬，張春艷，張 巖，吳皓宇，胡艷超，鄭 陽，范雅潔，姚智會，王聰霞，葛 淼

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710068；3. 陜西師范大學旅游與環(huán)境學院，陜西西安 710062)

糖尿病作為獨立的危險因素加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展，長期高糖血癥被認為是導致心血管疾病并發(fā)癥的關(guān)鍵因子[1]，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的過度增殖是糖尿病心血管并發(fā)癥的主要細胞生物學基礎(chǔ)。miRNA是一類小的(22 nt)單鏈非編碼RNA 分子，通過靶標mRNA的3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)導致靶基因降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，涉及到包括增殖、分化、凋亡和代謝等多種細胞進程[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA高表達于VSMC，通過靶標轉(zhuǎn)錄因子及細胞骨架等廣泛參與調(diào)節(jié)VSMC的分化、增殖和遷移[3-5]。本實驗模擬體內(nèi)高糖環(huán)境對人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cell, HASMC)進行刺激，研究miRNA-21(miR-21)在HASMC表型轉(zhuǎn)化和增殖中的分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑HASMC(江陰齊氏生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，BI公司)；D-葡萄糖(Sigma公司)；RNA提取試劑、脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料試劑盒(TaKaRa公司)；RIPA裂解液(Heart生物有限公司)；兔抗人TPM1單克隆抗體(CST公司)；兔抗人骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、平滑肌蛋白22α(smooth muscle 22 alpha, SM22α)單克隆抗體(Proteintech公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠及羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)；Western blot相關(guān)試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；BrdU標記及檢測試劑盒(Roche公司)。

1.2細胞培養(yǎng)與實驗分組用含100 mL/L FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基(含有D-葡萄糖5 mmol/L)中培養(yǎng)HASMC，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取3～6代細胞進行隨機分組：正常糖組即正常對照組(NG，5.5 mmol/L D-葡萄糖)、各高糖組(HG，10、20、25 mmol/L D-葡萄糖)。分組前換用含4 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液同步24 h后，各高糖組按照分組分別加入相應濃度D-葡萄糖于含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)6個復孔。

1.3BrdU摻入法測定細胞增殖將制備的HASMC懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液100 μL，含5 000個細胞。經(jīng)細胞培養(yǎng)箱孵育24 h，觀察細胞生長狀態(tài)良好，分別加入不同濃度的D-葡萄糖，細胞繼續(xù)孵育24 h終止培養(yǎng)。每孔加入BrdU 10 μL標記細胞，37 ℃孵育2 h，棄培養(yǎng)液；每孔加入200 μL FixDenat固定液于室溫固定30 min；棄固定液，每孔加入100 μL Anti-BrdU-POD液并室溫放置90 min；吸棄抗體，每孔加洗滌工作液200～300 μL，共洗3次；加底物溶液100 μL，室溫放置30 min。每孔加25 μL終止反應液(1 mol/L H2SO4)，5 min內(nèi)酶標儀測量。

1.4轉(zhuǎn)染及分組miR-21 mimic、miR-21 inhibitor和TPM1 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計合成，TPM1 siRNA正義鏈：5′-GCUCGUAAGUUGGUGAUU-ATT-3′，反義鏈：5′-UAAUCACCAACUUACGAG-CTT-3′，miR-21 mimic序列反義鏈：5′-AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′，正義鏈：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，miR-21 inhibitor 序列：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。使用不含血清的培養(yǎng)基稀釋miR-21 mimic和inhibitor，使其與lipo-2000混合使終濃度至50 nmol/L，加入含有細胞的培養(yǎng)基中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染模擬miR-21過表達與缺失。Vehicle為空白對照，miR control為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h后，分別提取總RNA及蛋白，應用PCR、Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率，并進行后續(xù)實驗。

1.5實時熒光定量RT-PCR檢測各組基因表達提取各組細胞總RNA，首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。然后PCR反應檢測miR-21表達，miR-21引物序列，上游5′-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3′，下游5′-GACTGTGACGACTACCCCAA-3′，內(nèi)參U6引物序列上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共循環(huán)40次。每組樣品3個復孔，實驗重復3次，并進行統(tǒng)計分析。

1.6免疫印跡法檢測蛋白表達2.5 g/L胰酶消化細胞，離心后PBS漂洗3次，細胞轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液中冰浴60 min，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，取上清即總蛋白。采用BCA法測蛋白濃度，30 μL蛋白量上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常規(guī)條件轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，麗春紅染色，50 g/L BSA/TBST 4 ℃封閉1 h后加1∶1 000兔抗TPM1、OPN、SM22α多抗孵育過夜，TBST漂洗3次后，加1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗兔(鼠)二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后，ECL化學發(fā)光顯影記錄。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度葡萄糖對HASMC增殖的影響在含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)HASMC 48 h，BrdU摻入法測定結(jié)果顯示，10、20、25 mmol/L葡萄糖組中BrdU摻入DNA的吸光度值分別為0.725±0.026、0.913±0.024、1.513±0.082，均高于正常對照組(0.613±0.022)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；組間相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。即在一定范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度的增加，細胞增殖增強。

2.2葡萄糖對HASMC中miR-21表達的影響實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測結(jié)果顯示，10、20、25 mmol/L葡萄糖組miR-21的表達分別為正常對照組的1.1、2.0、3.1倍，差異有統(tǒng)計學意義，組間相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。即隨著培養(yǎng)液葡萄糖濃度的增加，HASMC中miR-21的表達呈濃度依賴性的增加。

2.3miR-21對HASMC細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組的HASMC中miR-21的水平增加后，HASMC增殖能力增強1.6倍(P<0.01)，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor HASMC中miR-21的水平下調(diào)時，再給予高糖刺激細胞12 h，高糖促細胞增殖作用得到了顯著抑制(P<0.01，圖2)。

2.4miR-21靶向作用于TPM1調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化從而抑制細胞增殖qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，在miR-21過表達和抑制的情況下，TPM1的mRNA沒有明顯變化，表明miR-21對TPM1 mRNA沒有影響(P>0.05，圖3A)。Western blot方法檢測結(jié)果顯示，在miR-21過表達的情況下，靶基因的蛋白質(zhì)水平明顯降低(P<0.01，圖3B)，而在miR-21表達抑制的情況下，靶基因的蛋白質(zhì)水平明顯升高(P<0.01，圖3C)，提示miR-21對TPM1作用表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的降解。

圖1qRT-PCR法檢測不同濃度葡萄糖培養(yǎng)時HASMC中miR-21的表達

Fig.1 Expression of miR-21 under high glucose detected by qRT-PCR

與正常對照組(NG)比較，*P<0.01；與10 mmol/L高葡萄糖組(HG)比較，#P<0.01；與20 mmol/L葡萄糖組比較，△P<0.01。

圖2miR-21對HASMC細胞增殖的影響

Fig.2 Effect of miR-21 on HG-induced HASMC proliferation

與相應對照組比較，**P<0.01。

miR-21過表達可以促進細胞增殖，miR-21減少可抑制細胞增殖；利用TPM1 siRNA降低TPM1表達后，miR-21 inhibitor抑制細胞增殖的作用減弱(圖4)。轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，VSMC合成表型標志蛋白OPN表達上調(diào)，VSMC收縮表型標志蛋白SM22α表達下調(diào)，提示細胞表型轉(zhuǎn)化為合成型；轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor 后，OPN表達下降，SM22α表達增加，提示細胞表型主要為收縮表型。通過TPM1 siRNA干擾降低TPM1表達量，再次觀察細胞表型轉(zhuǎn)化及細胞增殖的變化。同時OPN表達上調(diào)，SM22α表達上調(diào)(圖4)，提示細胞表型轉(zhuǎn)化為合成型，進一步證明miR-21對HASMC增殖和表型轉(zhuǎn)化作用部分是通過TPM1完成的。

圖3miR-21轉(zhuǎn)染HASMC細胞中TPM1的mRNA(A)和蛋白(B、C)的表達

Fig.3 The mRNA (A) and protein (B, C) expressions of TPM1 in miR-21 transfection HASMCs

與空白對照組(Vehicle)比較，**P<0.01。

圖4miR-21靶作用于TPM1調(diào)節(jié)VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)化

Fig.4 miR-21 regulated VSMC proliferation and phenotype switching via TPM1

A：miR-21 mimic組細胞增殖能力增強，miR-21 inhibitor組細胞增殖能力減弱；TPM1 siRNA組細胞增殖能力增強；B： miR-21 mimic組OPN表達上調(diào)，SM22α表達下調(diào)；miR-21 inhibitor 組OPN表達下降，SM22α表達增加；TPM1 siRNA組OPN表達增加，SM22α表達減少；與空白對照組(Vehicle)比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

慢性高血糖是糖尿病心血管并發(fā)癥的主要誘發(fā)因素。越來越多的證據(jù)表明高血糖促進了VSMC增殖和細胞周期進程，在糖尿病血管病變進展中起著重要作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)在高濃度的葡萄糖培養(yǎng)下，VSMC增殖能力明顯增加，且具有明顯的濃度依賴性，這與以往的研究結(jié)果一致。

VSMC根據(jù)其形態(tài)、功能及細胞標志蛋白的不同可分為收縮型和合成型2種表型。正常血管壁VSMC為收縮表型，含有大量微絲束，表達屬于細胞骨架蛋白家族的分化標記蛋白，主要包括α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α -SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain, SM-MHC)、SM22α、平滑肌蛋白(smoothelin蛋白)、細胞視黃醇結(jié)合蛋白-1(cellular retinol binding protein, CRBP-1)，其主要功能是調(diào)節(jié)血管舒縮。在血管內(nèi)皮受到損傷、機械性刺激(如血管的拉伸、血流的剪切應力)或血小板和炎癥細胞釋放的如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast grow factor-2, FGF-2)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)、內(nèi)皮素-1、白細胞介素的刺激下[7]，VSMC去分化為合成表型，其細胞質(zhì)內(nèi)含有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達的高爾基體，上述VSMC的分化標記蛋白表達減少或消失，VSMC增殖遷移能力增強，參與血管的重塑[8]。VSMC增殖和遷移是新生內(nèi)膜增厚、動脈粥樣硬化和再狹窄病變形成的必要過程。

一些轉(zhuǎn)錄因子，包括血清反應因子(serum response factor, SRF)、心肌素、心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(myocardin related transcription factors, MRTFs)和Krüppel樣鋅指家族成員(krüppel like zinc finger family, KLF)等被證實作為關(guān)鍵分子參與調(diào)節(jié)VSMC分化。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以通過調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達，在VSMC的分化和增殖中發(fā)揮了重要作用；此外，一些miRNA直接參與了VSMC的表型轉(zhuǎn)化和內(nèi)膜增厚。迄今為止，miR-143/145、miR-21、miR-221、miR-223在VSMC分化增殖中受到最多的關(guān)注[9-11]。miR-145已被證實是分化成熟的VSMC標志物。過表達miR-143和miR-145可以促進VSMC向分化表型轉(zhuǎn)化。在大鼠頸動脈內(nèi)膜增厚的模型中可發(fā)現(xiàn)miR-145表達降低，而且在對敲除了mi-145和miR-143的小鼠進行頸動脈結(jié)扎術(shù)后，小鼠的新生內(nèi)膜增厚明顯減少[10]。此外，在體外培養(yǎng)的增殖VSMC和體內(nèi)大鼠頸動脈球囊損傷后的新生內(nèi)膜中均可觀察到miR-221和miR-223表達上調(diào)[4]。JI等[12]發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過下調(diào)PTEN和上調(diào)Bcl-2的表達而抑制VSMC凋亡及促進VSMC增殖。此外，在TGF-β和骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)刺激下，miR-21促進了VSMC分化與增殖，推測與其靶基因程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death protein 4, PDCD4)的表達減少有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，HASMC在高糖刺激下增殖能力增強且miR-21表達水平明顯升高，在過表達miR-21時，VSMC的增殖能力進一步增強。同時，觀察到在過表達miR-21時，VSMC的收縮表型蛋白SM-22α明顯降低，合成表型蛋白OPN表達增加；而在抑制miR-21表達時，VSMC增殖能力減弱，收縮表型蛋白SM22α表達上調(diào)。說明miR-21有促進VSMC表型轉(zhuǎn)化與增殖的作用。

TPM1作為肌動蛋白結(jié)合蛋白的家族成員之一，不僅調(diào)節(jié)平滑肌和橫紋肌的收縮系統(tǒng)功能，還在細胞形態(tài)和功能的調(diào)節(jié)中也起著重要作用。非肌源性的TPM1目前在腫瘤學中研究較多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TPM1在乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細胞瘤、前列腺癌等其他腫瘤中表達都是下調(diào)的，推測其可能作為一種腫瘤抑制因子在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。在心血管方面，TPM1對心臟和血管的發(fā)育起著重要作用，其突變或缺失可能與心肌病和先天性心臟病的發(fā)生有著密切關(guān)系[14]。此外，有研究表明兔平滑肌TPM1的表達與VSMC表型轉(zhuǎn)換關(guān)系密切[15]，但TPM1在人VSMC中的作用尚不明確。本研究從HASMC入手，發(fā)現(xiàn)miR-21可以靶向作用于TPM1，使其蛋白表達下調(diào)而mRNA表達并沒有明顯改變，從而發(fā)現(xiàn)VSMC收縮表型標志蛋白SM22α表達下調(diào)，而合成表型標志蛋白OPN表達上調(diào)，提示TPM1具有抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化增殖的作用。在miR-21過表達時，TPM1表達明顯下降，與VSMC的表型轉(zhuǎn)化和增殖表現(xiàn)一致。而在抑制miR-21表達后，TPM1表達上調(diào)，與此同時VSMC的表型主要表現(xiàn)為收縮表型且增殖能力下降。結(jié)果提示TPM1的下調(diào)使得細胞骨架蛋白表達失衡，從而引起細胞表型轉(zhuǎn)化繼而增殖遷移。

本實驗通過模擬體內(nèi)高糖環(huán)境對HASMC進行刺激，結(jié)果表明miR-21表達明顯上調(diào)，HASMC轉(zhuǎn)化為合成表型且增殖能力增強，其可能是通過下調(diào)TPM1作用而實現(xiàn)。

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