澤漆中金絲桃苷的提取工藝

陳 健，王 丹，Aun Raza，湯 建，歐陽臻

(江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

澤漆 (EuphorbiahelioscopiaL.)，又名貓眼草、五朵云等。一年生或者兩年生草本，高10～30 cm，全株含有白色乳汁。澤漆生于川澤，莖梗小，有葉，花黃，四五月采之[1]。臨床用于治療腹水、水腫、肺結(jié)核、頸淋巴結(jié)核、痰多喘咳、癬瘡，民間還用于治療宮頸癌、食道癌等[2]。早前的研究主要關(guān)注二萜酯類化合物及其生物活性。近年來報道澤漆含有豐富的槲皮素及槲皮素為母核的黃酮苷類化合物，其中金絲桃苷(hyperoside)是主要的黃酮苷類成分之一[1-2]。金絲桃苷具有保肝、神經(jīng)保護、抗炎癥、抗癌、抗氧化應激、抗微血栓形成及對保護心腦缺血損傷的藥理作用，且無遺傳毒性[3]。目前市場上提供的金絲桃苷以植物提取為主[3-4]，因此發(fā)現(xiàn)富含該化合物的植物資源，建立高效環(huán)保的制備金絲桃苷的工藝，對于深入研究該化合物具有實際意義。

前期研究中發(fā)現(xiàn)野生植物澤漆中含有豐富的金絲桃苷及2''-O-沒食子酰基金絲桃苷(2''-O-galloyl hyperoside)，并且植物資源豐富，價格低廉[5]。2''-O-沒食子酰基金絲桃苷在堿性條件下可以水解失去沒食子?；?yōu)榻鸾z桃苷，采用NaOH溶液處理澤漆藥材可以方便地制得金絲桃苷。本文旨在采用正交試驗優(yōu)化澤漆中金絲桃苷的提取工藝，為金絲桃苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

澤漆藥材于2015年4月收集于江蘇鎮(zhèn)江，經(jīng)本院歐陽臻教授鑒定為大戟科大戟屬植物澤漆(EuphorbiahelioscopiaL.)。澤漆地上部分干燥，粉碎至10～20目，冷藏備用。金絲桃苷對照品為本實驗室自制；甲醇(色譜純)、雙純水；其他試劑及化學品為分析純。

Sartorius電子天平；LC-20A高效液相色譜儀(Shimadzu)。

2 實驗方法

2.1 HPLC-UV分析[6]

色譜柱為Gracesmart RP-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μmol/L)；流動相為甲醇-水(40∶60)；流速：0.8 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量20 μL。

精密稱取4.9 mg金絲桃苷用乙醇溶解，配成濃度為0.49 mg/mL的溶液，逐級稀釋制備系列濃度的標準品溶液。HPLC測得峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)制備標準曲線。所有樣品10 000 r/min離心3 min，取上清液進樣。

2.2 單因素考察[7]

2.2.1 溶液pH值的考察

4份樣品(0.5 g)中分別加入9 mL，8.5 mL，8 mL和7.5 mL 30%乙醇，再依次加入不同體積0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇濃度30%)，最后用30%乙醇補至終體積10 mL， pH值分別為8，9，10，11。在液料比20∶1，25 ℃條件下浸漬12 h，過濾，濾液用5%鹽酸調(diào)pH 5～6，靜置備用。

2.2.2 液料比的考察

4份樣品(0.5 g)中分別加入體積為5.5 mL，8 mL，10.5 mL，13 mL(液料比15∶1，20∶1，25∶1和30∶1)的30%乙醇，再加入不同體積0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇濃度30%)，最后用30%乙醇補至終體積分別為7.5 mL，10 mL，12.5 mL和15 mL。在pH 10，25 ℃條件下浸漬12 h，過濾，濾液調(diào)pH 5～6，靜置備用。

2.2.3 浸漬時間的考察

4份樣品(0.5 g)中依次加入8 mL 30%乙醇和0.4 mol/L的NaOH乙醇溶液(乙醇濃度30%)，最后用30%乙醇補至終體積10 mL。在pH 10，液料比20∶1，25℃條件下分別浸漬8 h，10 h，12 h和14 h，過濾，濾液調(diào)pH 5～6，靜置備用。

2.2.4 浸漬溫度的考察

4份樣品(0.5 g)中依次加入8 mL 30%乙醇和0.4 mol/L的NaOH乙醇溶液(乙醇濃度30%)，最后用30%乙醇補至終體積10 mL。在pH 10，液料比20∶1條件下，分別于10 ℃，25 ℃，40 ℃和55 ℃溫度下浸漬12 h。過濾，濾液調(diào)pH 5～6，靜置備用。

2.3 正交試驗優(yōu)選澤漆中金絲桃苷成分的提取工藝[8]

2. 3.1 正交試驗表設(shè)計

從pH值(A)、液料比(B)、浸漬時間(C)以及浸漬溫度(D)四種因素中，選擇三種因素進行L9(34)正交試驗考察，以金絲桃苷的含量為考察指標，進行提取工藝優(yōu)化。

2. 3.2 供試品溶液的制備

精密稱取9份藥材粉末，每份0.5 g，放入提取管中，每三管一組，按組分別加入不同體積30%乙醇溶液和0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇濃度30%)，按照正交試驗設(shè)計進行提取，提取液過濾，調(diào)pH 5～6，靜置備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-UV分析

金絲桃苷的線性回歸方程y=32 483 986x-693.354，r=0.999 7，結(jié)果表明金絲桃苷濃度在1.12～147.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 單因素考察

3.2.1 溶液pH值的影響

在液料比20∶1、浸漬時間12 h條件下，考察pH對金絲桃苷提取率的影響。發(fā)現(xiàn)在溶劑pH 10左右時，藥材中的金絲桃苷(1)含量明顯增加(如圖1)，而超聲10 min的30%乙醇提取液中，2''-O-沒食子酰基金絲桃苷(2)的含量遠高于金絲桃苷。

根據(jù)圖2(A)可知，pH 9～11的30%乙醇溶液提取金絲桃苷有較高得率，且pH值對金絲桃苷的提取率影響非常顯著，但pH 11條件下金絲桃苷含量開始下降。

3.2.2 液料比的影響

pH 10，浸漬時間為12 h，考察液料比對提取的影響，其結(jié)果如圖2(B)所示。由圖2可以看出，當液料比達到20∶1后，提取金絲桃苷的量趨于穩(wěn)定。故選擇20∶1的液料比進行下一步操作。

圖1 樣品HPLC圖(A: 澤漆30%乙醇提取液； B: 澤漆30%乙醇(pH10)提取液；

3.2.3 浸漬時間的考察

pH 10，液料比為20∶1的條件下，考察浸漬時間對提取金絲桃苷的影響，其結(jié)果如圖2(C)所示。由圖可知，浸漬時間達到12 h，提取金絲桃苷的量趨于平穩(wěn)。故下一步操作中藥材浸漬12 h。

3.2.4 浸漬溫度的考察

pH 10，液料比為20∶1，浸漬12 h的條件下，考察浸漬溫度對提取率的影響。其結(jié)果如圖2(D)所示。由圖可知，溫度對金絲桃苷的提取率具有一定影響，55 ℃條件下，金絲桃苷的含量明顯下降，而25 ℃和40 ℃條件下，金絲桃苷提取率基本一致。結(jié)合預試驗結(jié)果，正交試驗中選擇25 ℃為浸漬溫度。

圖2 四種因素對金絲桃苷提取率的影響

3.3 正交試驗優(yōu)選澤漆中金絲桃苷成分的提取工藝

3.3.1 正交試驗表設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上選擇pH值(A)、液料比(B)和浸漬時間(C)三種因素設(shè)計正交試驗，以確定最優(yōu)提取工藝。以金絲桃苷為考察指標，正交試驗設(shè)計見表1。

表1 優(yōu)選澤漆中金絲桃苷提取工藝正交試驗因素水平

根據(jù)單因素實驗可知，溶劑pH值、液料比和浸漬時間的選擇區(qū)間分別是9～11，15∶1～25∶1，10～14 h，浸漬溫度設(shè)定25 ℃。

3.3.2 正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗設(shè)計表及直觀分析結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

由表2、3直觀分析及方差分析，影響提取工藝的因素順序為A>B>C，其中pH值(A)對提取有最大影響且有顯著性意義。同時從金絲桃苷含量來看應該選擇A2B2C2，即在25℃，pH 10，液料比20∶1，浸漬12 h為實際最佳工藝條件。

同時還考察了超聲對金絲桃苷提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)在液料比1︰20，pH為10條件下，藥材先浸漬10 min，再分別超聲5 min，10 min，15 min，生藥材中的金絲桃苷提取率分別為27.56%，38.85%，55.79%。隨時間的延長，提取液中金絲桃苷的含量并未顯著增加，并且超聲15 min后仍有35%左右的2''-O-沒食子?；鸾z桃苷存在。

4 結(jié) 論

目前關(guān)于金絲桃苷的原料來源主要是藤黃科植物(貫葉連翹)、薔薇科植物(山楂)、鹿蹄草科(鹿銜草)、錦葵科(黃蜀葵)等[4]，但我們發(fā)現(xiàn)野生植物澤漆中含有豐富的金絲桃苷及其沒食子酰基衍生物，并且資源豐富，藥材價格低廉。最優(yōu)條件下所得提取液經(jīng)HPLC分析，金絲桃苷的提取率達2.286 mg/g，較生藥材中的含量(1.197 mg/g)有大幅提高，而2''-O-沒食子酰基金絲桃苷基本消失。這是因為沒食子?；苌镌谔崛∵^程中水解(pH 10)而變?yōu)榻鸾z桃苷的緣故。

金絲桃苷等黃酮類化合物在抗炎、神經(jīng)保護、特別是心腦血管疾病方面具有良好的應用潛力。本文優(yōu)化得到的制備金絲桃苷的工藝，簡單易行，條件溫和，得率較高，且原料豐富。同時對深入研究金絲桃苷的生物活性及在臨床和膳食方面的應用具有重要意義。

參考文獻：

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