豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的可溶性表達

熊文麗，巫水根，蔡 振，蔣 燁，嚴 芬，吳元子

(福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350100)

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)是一類在豬群中廣泛存在的傳染性疾病，給世界豬養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經濟損失.研究表明引起此類疾病的病原體主要是豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)[1-4].該病毒為單鏈DNA病毒，有一條閉合環(huán)狀單鏈DNA[5].PCV基因組主要有兩個閱讀框架，即ORF1和ORF2，ORF1編碼病毒DNA復制所必需的相關蛋白(Rep)，而ORF2基因表達產物主要是病毒結構蛋白(Cap)[6].Cap蛋白構成病毒的衣殼蛋白，其分子量約30 kD[7-8].Cap蛋白具有免疫原性，能夠誘導機體產生特異性免疫應答，因此Cap蛋白可作為研制亞單位疫苗的首選靶抗原[9].

與傳統(tǒng)滅活或減毒疫苗相比，亞單位疫苗在安全性上具有獨特的優(yōu)勢[10].針對豬圓環(huán)病毒的亞單位疫苗業(yè)已經成功開發(fā)并上市，如豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗，具有良好的免疫效果，在市場上得到廣泛的應用.但由于其表達系統(tǒng)來自于昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，對設備要求苛刻，成本昂貴，疫苗價格相對較高.

大腸桿菌表達系統(tǒng)具備成本低，周期短的優(yōu)勢，但應用于Cap蛋白表達有一定的困難.已有研究表明，Cap蛋白自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)的過程中，核酸定位序列起到重要的作用[11].遺憾的是，該段序列中包含了9個精氨酸.精氨酸對于大腸桿菌系統(tǒng)而言屬于稀有氨基酸.因此，核酸定位序列的存在制約了Cap蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中大量表達[12].

針對Cap蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的低表達問題，課題組對核酸定位序列進行優(yōu)化處理，促使其在大腸桿菌中大量表達[13].在此基礎上，本文采用優(yōu)化密碼子的全長基因序列，選用谷胱甘肽S-轉移酶(GST)作為融合標簽，實現全長Cap蛋白的可溶性表達，并驗證其抗原活性，為進一步的亞單位疫苗制備奠定了基礎.

1.1 材料

BL21(DE3)、Top 10取自實驗室保存.質粒pMD-18T和pGEX4T-1、質粒提取試劑盒、2×Easy TaqTMSuperMix(+dye)、羊抗 PCV2 Cap蛋白、兔抗羊 IgGHRP、ProteinIsoTMGST Resin、PVDF(0.22 μm)、Stained Protein Molecular Weight Marker、ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司.核酸染料購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司.DL2000 DNA Marker、限制性酶切酶、DNA連接酶、T4連接酶購于寶生物工程(大連)有限公司.Unstained Protein Molecular Weight Marker購于Thermo Fisher Scientific.Tris、甘氨酸、還原型谷胱甘肽購買于上海生工生物工程有限公司.甲醇、鹽酸購于國藥集團化學試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pGEX-ORF2的構建

1 材料和方法

圖1 重組質粒pGEX-ORF2圖譜Fig.1 Map of recombinant plasmid pGEX-ORF2

合成NLS密碼子優(yōu)化的Cap蛋白基因引物并進行 PCR 擴增[14]，上游引物:5’-GGATCCATGACGTATCCACGCCGCCGT-3’(下劃線為 BamH I位點)；下游引物:5’-CTCGAGAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’(下劃線為Xho I位點).目的片段和質粒pMD-18T連接過夜，將酶連產物通過氯化鈣轉化法轉化至大腸桿菌Top 10，構建Top 10-pMD18T-ORF2重組菌株.將重組質粒pMD18T-ORF2和pGEX4T-1經BamH I、Xho I酶切，并在DNA連接酶作用下，構建重組質粒pGEXORF2(圖1).隨后將重組質粒轉化進入BL21(DE3)，進行PCR鑒定和DNA序列分析(英濰捷基，上海).1.2.2 GST-Cap蛋白的誘導表達

挑取陽性克隆菌株BL21-pGEX-ORF2于LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度100 μg/mL氨芐青霉素，37℃，200 rpm過夜.第二天進行菌株轉接，37°C，200 rpm.震蕩3 h至生長對數中期(OD600＝0.6-0.8)加入終濃度為1 mM IPTG進行誘導表達，2 h后停止培養(yǎng).10000 rpm離心1 min后收集菌體.加入蛋白處理液，在沸水中煮沸7 min，10000 rpm離心1 min.將未誘導的菌株作為陰性對照，利用12%SDS-PAGE進行分析.

1.2.3 純化GST-Cap蛋白

擴大培養(yǎng)進行菌體收集，菌體破碎后收集細胞裂解液在4°C，12000 rpm條件下離心30 min后收集上清并過濾.ProteinIsoTMGST Resin分離純化過程包括:平衡，用10倍體積上樣緩沖液(PBS)平衡層析柱，使得基線平穩(wěn).上樣:將過濾后的樣品，以1 mL/min流速上樣.洗脫:洗脫緩沖液(50 mM Tris-HCl，10 mM還原型谷胱甘肽，pH ＝8.0)以相同流速進行洗脫.收集洗脫液，加入凝血酶在16°C下酶切過夜.

1.2.4 蛋白活性分析

將重組蛋白上清液經ProteinIsoTMGST Resin純化后得到的GST-Cap蛋白以及GST-Cap酶切后蛋白加入蛋白處理液，沸水煮沸7 min后進行SDS-PAGE.電泳結束后將凝膠置于轉膜緩沖液中進行轉膜.轉膜結束后使用含5%脫脂牛奶的TBST中室溫封閉1 h，接著在兔抗PCV2單克隆抗體中4°C孵育過夜，加入羊抗兔HRP-IgG，室溫孵育1 h后顯色成像.

2 結果與討論

2.1 構建pGEX-ORF2-Cap表達載體

重組質粒pGEX-ORF2結果如圖2所示.在750 bp附近有一條明亮的條帶且沒有存在其他非特異性的擴增條帶，表明成功獲得目的基因片段(圖2-A).進一步進行雙酶切驗證，如圖2-B，在750 bp左右有明顯條帶，表明 ORF2基因已成功克隆至質粒pGEX4T-1.將重組質粒 pGEX-ORF2轉化到 BL21(DE3)，挑取四株轉化子進行PCR驗證，如圖2-C可見每個泳道在750 bp左右有明亮的條帶，表明BL21-pGEX-ORF2表達菌株構建成功.進一步的DNA序列分析發(fā)現測序結果與預期一致.

圖2 構建重組表達質粒pGEX-ORF2.Fig.2 Construction of recombinant expression plasmid pGEX-ORF2

2.2 GST-Cap蛋白可溶性分析及蛋白純化

SDS-PAGE對構建成功的重組菌株進行誘導表達分析.如圖3-A所示，泳道2、3、4與未誘導菌體泳道1相比在相對分子質量約為55 kD處蛋白表達量明顯增多，表明GST-Cap融合蛋白表達成功.進一步對菌體破碎后的上清和沉淀進行可溶性分析.如圖3-B所示，上清泳道1在55 kD處有較深的條帶，沉淀泳道2中相應位置條帶顏色很淡，這說明GST-Cap可溶性表達成功，且大部分以可溶形式存在，少部分蛋白沉淀推測以包涵體形式存在.與His標簽相比，利用GST標簽對ORF2基因進行融合表達，促進全長衣殼蛋白的可溶性表達[13，15].利用GST標簽親和柱純化目標融合蛋白.如圖3-C，分別收集流出峰與洗脫峰，進行SDS-PAGE.對應于圖3-D中的泳道1和2.洗脫泳道2在55 kD處有明顯的目的條帶，且雜帶少，說明GST-Cap融合蛋白可溶性表達成功，并能夠特異性地吸附到親和層析柱上.

圖3 GST-Cap蛋白可溶性分析及純化Fig.3 GST-Cap protein solubility analysis and purification

2.3 GST-Cap蛋白抗原活性及粒徑分析

圖4 GST-Cap蛋白抗原活性檢測及粒度表征Fig 4 The antigen activity detection of GST-Cap protein and particle size characterization

利用凝血酶特異性酶切GST-Cap融合蛋白[16].利用SDS-PAGE及免疫印跡分析等技術進行表征.如圖4-A所示，相對于酶切前(泳道1)，凝血酶酶切后融合蛋白在55 kD處條帶消失，并在30 kD左右處出現兩條新條帶，表明GST標簽被成功酶切.進一步的免疫印跡實驗表明酶切后的Cap蛋白能夠特異性地與羊抗PCV2抗體特異性結合，表明Cap蛋白具有一定的抗原活性，但活性偏低.為研究這一現象，我們進一步使用動態(tài)光散射儀檢測蛋白粒徑大小，如圖4-B可以看到蛋白粒徑出現了兩個峰，峰1對應于蛋白粒徑30 nm，與豬圓環(huán)病毒樣顆尺度相當，推測有部分蛋白通過自組裝形成了病毒樣顆粒.峰2對應于蛋白粒徑131 nm.實驗結果表明雖然GST-Cap蛋白電泳驗證為可溶性表達，但凝血酶酶切掉起到GST標簽后，部分Cap蛋白由于疏水性作用，發(fā)生輕微的團聚，進而影響了其抗原活性.

核酸定位序列制約了Cap蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達[12].已有研究表明，不包含核酸定位序列的短截Cap蛋白即可在大腸桿菌系統(tǒng)中表達[16].但是該序列的缺失，對后期衣殼蛋白組裝有很大的影響.本研究中，通過密碼子優(yōu)化，成功在大腸桿菌中實現了全長Cap蛋白的大量可溶性表達.

3 結論

大腸桿菌表達系統(tǒng)具有操作簡單、培養(yǎng)周期短等優(yōu)點，所以使用大腸桿菌表達全長豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白是理想的表達系統(tǒng).本工作成功構建BL21-pGEXORF2表達菌株，并實現豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的可溶性表達，避免了復雜的包涵體復性過程.表達出來的衣殼蛋白經免疫印跡檢測，鑒定了融合蛋白具有免疫原性.該工作為進一步的豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗制備奠定了基礎.

[1]SEGALéS J， DOMINGO M.Postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)in pigs.A review[J].Veterinary Quarterly，2002，24(3):109-124.

[2]LóPEZSORIA S，NOFRARíAS M，et al.Post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)clinical expression under field conditions is modulated by the pig genetic background[J].Veterinary Microbiology，2011，149(3):352-357.

[3]ALLAN G M，MCNEILLY F，KENNEDY S，et al.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，1998，10(1):3-10.

[4]MARTELLI P，FERRARI L，MORGANTI M，et al.One dose of a porcine circovirus 2 subunit vaccine induces humoral and cell-mediated immunity and protects against porcine circovirus-associated disease under field conditions[J].Veterinary Microbiology，2011，149(4):339-351.

[5]TISCHER I，GELDERBLOM H，VETTERMANN W，et al.A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J].Nature，1982，295(5844):64-66.

[6]HAMEL A L，LIN L L，AND NAYAR G P.Nucleotide Sequence of Porcine Circovirus Associated with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in Pigs[J].Journal of Virology，1989，72(6):5262-5267.

[7]MANKERTZ A，PERSSON F，MANKERTZ J，et al.Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus[J].Journal of Virology，1997，7(3):2562-2566.

[8]NAWAGITGUL P，MOROZOV I，BOLIN S R，et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].Journal of General Virology，2000，81(9):2281-2287.

[9]FAN H，JU C，TONG T，et al.Immunogenicity of empty capsids of porcine circovius type 2 produced in Insect Cells[J].Veterinary Research Communications，2007，31(4):487-496.

[10]郭文龍，朱瑞良.基因工程亞單位疫苗的研究現狀及發(fā)展動態(tài)[J].國外畜牧學-豬與禽，2008，28(4):72-75.

[11]LIU Q，TIKOO S K，BABIUK L A.Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2[J].Virology，2001，285(1):91-99.

[12]MARCEKOVA Z，PSIKAL I，KOSINOVA E，et al.Heterologous expression of full-length capsid protein of porcine circovirus 2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies[J].Journal of Virological Methods，2009，162(2):133-141.

[13]陳靈艷，陳先進，蔣燁，呂暾.豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達研究[J].生物技術通報，2016，32(5):140-145.

[14]呂暾，陳靈艷，陳晟生，等.優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2基因的NLS序列[P].中國，2014100617213，2014-02-24.

[15]SMITH D B，JOHNSON K S.Single-step purification of polypetides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase[J].Gene，1988，67:31-40.

[16]ZHOU J Y，SHANG S B，GONG H，et al.In vitro expression，monoclonal antibody and bioactivity for capsid protein of porcine circovirus type II without nuclear localization signal[J].Journal of Biotechnology，2005，118(2):201-211.