幾丁質(zhì)酶對(duì)香菇多糖提取的影響

李俊峰，張揚(yáng)揚(yáng)，李 明

（通化師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林通化 134001）

香菇為擔(dān)子菌亞門(mén)，擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科。香菇屬真菌，因其口味鮮美、香味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富，有顯著的藥用及滋補(bǔ)作用而被譽(yù)為“蘑菇皇后”“抗癌新兵”“菌中之秀”[1]。香菇多糖是從香菇中分離出的一種高純度、高分子結(jié)構(gòu)的葡聚糖[2]，在免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒和抗感染等方面有很強(qiáng)的活性，其療效高、毒副作用小，具有很高的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，香菇多糖被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域[5-6]。目前，多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、稀酸稀堿浸提法、微波提取法、酶解法等幾種方法[7]。傳統(tǒng)的浸提法時(shí)間長(zhǎng)、得率低、能耗大，為克服傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)，許多學(xué)者研究了亞臨界水提取法[8]，超臨界二氧化碳萃取技術(shù)與熱水浸提法[9-10]，超濾膜技術(shù)提取法[11]、纖維素酶協(xié)同超聲波法[12]、響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提法[13]等。

研究顯示，在香菇等真菌類(lèi)食品原料中，活性多糖主要存在于由纖維素和幾丁質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞壁中[14]。為了提取活性多糖，首先必須破壞纖維素和幾丁質(zhì)在細(xì)胞壁中構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而將活性多糖釋放出來(lái)，才能充分并有效地提取活性多糖。但是，在現(xiàn)有的酶法提取香菇多糖的試驗(yàn)中，主要研究纖維素酶、果膠酶和蛋白酶對(duì)香菇多糖提取的影響，而幾丁質(zhì)酶在香菇多糖的提取研究中還沒(méi)有報(bào)道，而幾丁質(zhì)酶的存在可能會(huì)阻礙一部分活性多糖的釋放，導(dǎo)致活性多糖不能被充分提取。

試驗(yàn)首次采用幾丁質(zhì)酶輔助提取香菇多糖，并與纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行對(duì)比，從而考查幾丁質(zhì)酶對(duì)酶法提取香菇多糖得率的影響。研究結(jié)果對(duì)補(bǔ)充香菇多糖提取的研究?jī)?nèi)容、促進(jìn)香菇多糖的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具一定的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干香菇（市售）；苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純；幾丁質(zhì)酶（活力≥200 U/g）、纖維素酶（活力≥400 U/mg）、果膠酶（活力≥50 U/g）、木瓜蛋白酶（活力≥800 U/mg），上海一基實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；SY200型振動(dòng)篩，新鄉(xiāng)市特昌振動(dòng)機(jī)械有限公司產(chǎn)品；TDL-40B型離心機(jī)，上海安婷科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州市煜城儀器有限公司產(chǎn)品；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香菇多糖的提取

（1）工藝流程。粉碎→過(guò)篩→稱(chēng)量→提取→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→醇沉→離心→多糖。

（2） 香菇多糖的提取。將干香菇粉碎過(guò)80目篩，稱(chēng)取一定量香菇干粉，回流提取，將提取液進(jìn)行抽濾，濃縮至1/3左右，用4倍體積的95%乙醇浸提12 h，離心后得到香菇多糖。1.3.2 熱水浸提法單因素試驗(yàn)

（1）不同料液比對(duì)香菇多糖得率的影響。固定提取溫度55℃，提取時(shí)間2 h，物料粒度80目，考查料液比為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35時(shí)，對(duì)香菇多糖得率的影響。

（2）不同提取溫度對(duì)香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取時(shí)間2 h，物料粒度80目，考查溫度為55，75，85，95，105℃時(shí)，對(duì)香菇多糖得率的影響。

（3）不同提取時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取溫度55℃，物料粒度80目，考查提取時(shí)間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h時(shí)，對(duì)香菇多糖得率的影響。

（4）不同物料粒度對(duì)香菇多糖得率的影響。固定料液比1∶25，提取溫度55℃，提取時(shí)間2 h，考查物料粒度為40，60，80，100，120目時(shí)，對(duì)香菇多糖得率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度、原料粒度4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3次平行。基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比分別為1∶25，1∶30，1∶35；提取時(shí)間分別為 1.5，2.0，2.5 h；粒度60，80，100目；提取溫度分別為75，85，105℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.4 酶法輔助提取香菇多糖

將干香菇粉碎過(guò)80目篩，稱(chēng)取5.00 g香菇干粉，加入125 mL蒸餾水中，加入酶制劑，在一定條件下酶解，酶解后于85℃條件下提取2 h，將提取液進(jìn)行抽濾，在濃縮至1/3左右，用4倍體積的95%乙醇浸提12 h，離心后得到香菇多糖。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 檢測(cè)方法

利用苯酚硫酸法[15]測(cè)定提取物中多糖含量，先制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后在相同條件下測(cè)定樣品吸光度，通過(guò)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出樣品得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.528 9X+0.054 4，R2=0.979 6。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 不同料液比對(duì)香菇多糖得率的影響

不同料液比對(duì)香菇多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同料液比對(duì)香菇多糖得率的影響

由圖2可知，提取過(guò)程中，料液比為1∶15～1∶25時(shí)，香菇多糖得率逐漸增高，可能是因?yàn)殡S著液料比的增加，提高了多糖從物料顆粒內(nèi)部向溶劑擴(kuò)散的傳質(zhì)效率，從而使多糖得率不斷上升。當(dāng)料液比在1∶25～1∶35時(shí)，得率的上升具有漸漸放緩的趨勢(shì)。根據(jù)試驗(yàn)所得結(jié)果，同時(shí)考慮提取成本，選擇為1∶25為最佳提取料液比。

2.2.2 不同提取溫度對(duì)香菇多糖得率的影響

不同提取溫度對(duì)香菇多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同提取溫度對(duì)香菇多糖得率的影響

由圖3可知，當(dāng)提取溫度為55～105℃時(shí)香菇多糖得率逐漸增高，之后放緩。當(dāng)提取溫度為105℃時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于溫度的上升提高了多糖在水中的溶解度，從而提高了多糖的得率。但是，當(dāng)提取溫度高于85℃時(shí)，多糖得率的上升并不顯著。因此，為了不增加提取過(guò)程的能耗，確定提取溫度為85℃。

2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響

不同提取時(shí)間對(duì)香菇多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間在1～2 h時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，香菇多糖得率也隨之增高。當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，香菇得率最高。當(dāng)提取時(shí)間在2～3 h時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，香菇多糖得率降低。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，香菇中的其他水溶性成分溶出增加，抑制了香菇多糖的溶出。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間為2 h。

2.2.4 不同物料粒度對(duì)香菇多糖得率的影響

不同物料粒度對(duì)香菇多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，粒度為40～80目時(shí)，香菇多糖得率隨物料粒度的增加而上升，當(dāng)物料粒度為80目時(shí)，香菇多糖得率最高。當(dāng)物料粒度在80～100目時(shí)，隨物料粒度的增加，香菇多糖得率不斷降低。這可能是因?yàn)榱６冗^(guò)低，在粉碎過(guò)程中破壞了香菇多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖得率降低。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定物料粒度為80目。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度、原料粒度4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，對(duì)香菇多糖得率影響因素由大到小為提取時(shí)間＞料液比＞物料粒度＞提取溫度。水平2的香菇得率最高，試驗(yàn)結(jié)果最好，試驗(yàn)水平組合為A1B2C2D2，而由K值可知，試驗(yàn)最佳組合為A3B2C2D2。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為1.678%，得率高于A1B3C2D2。由正交試驗(yàn)可得，香菇多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶35，提取溫度105℃，提取時(shí)間2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率為1.678%。

2.4 酶對(duì)香菇多糖得率的影響

為了得出幾丁質(zhì)酶對(duì)香菇多糖的影響，試驗(yàn)中將幾丁質(zhì)酶與木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的酶法輔助提取結(jié)果進(jìn)行了比較。

不同酶法輔助提取香菇多糖的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同酶法輔助提取香菇多糖的結(jié)果

通過(guò)查閱酶法提取香菇多糖的研究文獻(xiàn)，歸納得出木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的最佳酶解條件為酶解溫度40℃左右，酶解pH值5左右，酶使用量0.5%左右。因此，為了將不同酶的提取結(jié)果進(jìn)行比較，試驗(yàn)中將4種酶的酶解條件保持一致。

由表3可知，酶法輔助提取香菇多糖的得率都高于水提法，且?guī)锥≠|(zhì)酶輔助提取法的得率最高。這一結(jié)論說(shuō)明，為了充分提取存在于香菇細(xì)胞壁中的活性多糖，必須破壞纖維素和幾丁質(zhì)在細(xì)胞壁中構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，僅破壞纖維素、蛋白質(zhì)和果膠還不足以充分提高多糖的得率。因此，研究結(jié)果證明，幾丁質(zhì)酶在提高香菇多糖的得率方面具有顯著作用。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考查了不同料液比、提取溫度、原料粒度和提取時(shí)間對(duì)香菇得率的影響，從而得出熱水提香菇多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶35，提取溫度105℃，提取時(shí)間2 h，物料粒度80目，香菇多糖得率為1.678%。酶法提取試驗(yàn)得出，木瓜蛋白酶提取香菇多糖得率為1.916%，果膠酶提取香菇多糖得率1.926%，纖維素酶提取香菇多糖得率1.684%，幾丁質(zhì)酶提取香菇多糖得率2.05%。研究結(jié)果可以證明，幾丁質(zhì)酶對(duì)香菇多糖的提取具有顯著的影響。

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