辣椒炭疽病病原菌生物學(xué)特性及其拮抗菌防效研究

李國光，田瑞華，趙 磊，周才芯，林瑞雄

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

位于呼和浩特市南部的托克托縣地處黃河中上游分界線拐彎處，是有名的辣椒種植區(qū)。當(dāng)?shù)厮a(chǎn)的“燈籠紅”辣椒具有色澤鮮艷、皮厚肉多、含水量低、糖分和含油量高等特點(diǎn)，富有“香而微辣”的美譽(yù)，也是農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的主要作物之一。但是，隨著當(dāng)?shù)乩苯贩N植面積的擴(kuò)大，農(nóng)耕用地面積的有限性，作物輪作存在困難，導(dǎo)致辣椒病害產(chǎn)生且逐漸擴(kuò)大，嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量和農(nóng)民的增收。去年，由于辣椒病害，當(dāng)?shù)乩苯樊a(chǎn)量僅僅是往年的一半，給農(nóng)民帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

據(jù)調(diào)查，托克托縣地區(qū)的辣椒病害是炭疽病，在高溫多雨的7月下旬最容易發(fā)病，具有傳播速度快、致病性強(qiáng)的特點(diǎn)。致病菌主要作用于辣椒果實(shí)，葉片也會(huì)染病，但不及果實(shí)嚴(yán)重。健康辣椒果實(shí)染病后，其病斑呈黃褐色，類似于水漬狀，中心有密布的紅色小點(diǎn)，并且呈同心圓狀，逐漸致使果實(shí)腐爛[1]。據(jù)報(bào)道，各地辣椒炭疽病致病的病原菌有一定的差異，主要有辣椒叢刺盤孢菌（Vermicularia capsici Syd）、辣椒盤長孢菌（G.piperatum Ell.et EV）、膠孢炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides） 等[2-3]。目前對(duì)辣椒炭疽病的防治主要是以化學(xué)防治為主，據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民反映，病害出現(xiàn)初期，噴施化學(xué)藥物有一定的防治作用，但是效果有限，不能持續(xù)。因此，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民來說，迫切需要一種高效、無害的防治辣椒炭疽病的方法。試驗(yàn)基于當(dāng)?shù)乩苯诽烤也『Φ陌l(fā)病特征，對(duì)致病菌的生物特性進(jìn)行研究，以篩選高效拮抗菌為目的，為建立托克托縣辣椒炭疽病的生物防治尋求新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試拮抗菌，拮抗菌從呼和浩特市周邊田地土壤中分離純化后所得，保藏于4℃冰箱中備用；供試?yán)苯?，來自呼和浩特市托克托縣農(nóng)戶辣椒種植區(qū)，分別采集具有典型癥狀的炭疽病發(fā)病果實(shí)和健康果實(shí)，保藏于自封袋中，用于病原菌分離和致病性檢測；培養(yǎng)基，病原菌和拮抗菌的分離純化及培養(yǎng)均采用PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化

采用植物組織分離法[4]，將辣椒炭疽病發(fā)病果實(shí)用無菌水沖洗3次，去除表面泥漬并晾干，用75%的酒精進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1%的氯化汞將辣椒表面消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次。在無菌條件下，在果實(shí)病斑邊緣處切取約3 mm×3 mm的組織塊并置于PDA平板上，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。每天觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長狀況，當(dāng)組織塊邊緣長出菌絲后及時(shí)挑取，并轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基中，重復(fù)上述過程，直至長出單菌落為止。純化后的病原菌保藏于4℃冰箱中備用。

1.2.2 病原菌致病性檢測及其鑒定

辣椒炭疽病致病性檢測依照柯赫準(zhǔn)則[5]。將病原菌活化后用無菌水制成菌懸液，在無菌條件下用接種針沾取少量病原菌菌懸液，刺入經(jīng)過消毒的新鮮健康辣椒果實(shí)和葉片組織深約1 mm，然后在其表面輕刮使其出現(xiàn)傷口，對(duì)照組用無菌水接種，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種后，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

將活化后的病原菌在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，觀察菌落特征，并在顯微鏡下觀察菌絲及孢子的形態(tài)學(xué)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》及rDNA-ITS序列分析[6]進(jìn)行鑒定。

1.2.3 培養(yǎng)條件對(duì)病原菌生長的影響

（1）溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響。無菌條件下用打孔器從活化后的病原菌邊緣打取直徑為4 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基平板的中央，分別置于溫度為 5，10，15，20，25，30，35，40 ℃條件下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，每隔1 d觀察菌絲生長狀況，并用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測量各菌落的直徑，每個(gè)處理設(shè) 3個(gè)重復(fù)。

（2）pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響。將直徑為4 mm的病原菌菌餅分別置于pH值為3，4，5，6，7，8，9，10的PDA平板培養(yǎng)基中，于28℃條件下恒溫培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測量各菌落的直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

（3）光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響。將直徑為4 mm的病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于完全光照、光暗交替（每12 h）、完全黑暗3種光照條件下，于28℃條件下恒溫培養(yǎng)3 d后，測量菌落直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

（4）培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長影響。將直徑為4 mm的病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基，置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后，測量菌落直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 拮抗菌及其發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用

（1）拮抗菌的抑菌作用。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[7]，用打孔器從病原菌邊緣打取直徑為4 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基平板的中央，然后在距病原菌菌餅5 mm處以十字交叉的方式各放置拮抗菌菌餅于十字的四端，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以病原菌作對(duì)照組，觀察抑菌效果，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

（2） 拮抗菌發(fā)酵液的抑菌作用。將拮抗菌于PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶恒溫培養(yǎng)，5 d后，將發(fā)酵液過濾滅菌，在無菌條件下取5 mL加入到未凝固的PDA平板中輕輕搖勻，待其凝固后接種病原菌菌餅，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以同等量的無菌水作為空白對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每天測定菌落直徑并計(jì)算抑菌率[8]。

1.2.5 拮抗菌對(duì)致病辣椒果實(shí)的防效試驗(yàn)

采取托縣辣椒種植區(qū)新鮮的辣椒果實(shí)，經(jīng)消毒后，分別設(shè)置A，B，C 3個(gè)處理，A處理用接種針接種病原菌進(jìn)行感染；B處理接種病原菌后，于病斑出現(xiàn)時(shí)噴施1次拮抗菌發(fā)酵液；C處理只接種拮抗菌發(fā)酵液。各處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于28℃條件下保濕恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察辣椒果實(shí)炭疽病發(fā)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性檢測及鑒定結(jié)果

從辣椒病斑邊緣分離純化后的單菌落菌懸液經(jīng)科赫法則進(jìn)行致病性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辣椒果實(shí)及植株葉片均會(huì)被感染，并出現(xiàn)黑斑，而對(duì)照組不受感染。果實(shí)上的病斑為近圓形或不規(guī)則形，病斑中部呈灰褐色，在其表面有稍微突起的同心圓紋，上面有小點(diǎn)附著，密布的小點(diǎn)主要為黑色，在濕度大的條件下，病斑表面有時(shí)會(huì)析出紅色物質(zhì)。葉片的病斑初期為水浸狀淺綠色斑點(diǎn)，后期形狀接近圓形，并且逐漸變?yōu)楹稚虚g為淡灰色，這與種植區(qū)辣椒病株的癥狀相似。將果實(shí)和葉片病斑處的組織按照上述方法進(jìn)行組織分離，得到的病原菌與試驗(yàn)病原菌形態(tài)一致，故可確定該病原菌就是托克托縣辣椒種植區(qū)炭疽病病原菌。

病原菌復(fù)染辣椒果實(shí)和葉片見圖1，病原菌形態(tài)特征見圖2。

圖1 病原菌復(fù)染辣椒果實(shí)和葉片

圖2 病原菌形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基菌落形態(tài)如圖2所示，菌絲生長速度較快，培養(yǎng)5 d后長滿培養(yǎng)皿，菌落呈圓形，中心有凸起，菌絲呈白色棉絮狀，氣生菌絲很發(fā)達(dá)。菌落在培養(yǎng)初期呈白色，后期在菌落中央出現(xiàn)粉紅色同心輪紋。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征顯示，病原菌菌絲有隔，具分枝，頂端有孢子囊，分生孢子梗及分生孢子無色，呈棒狀，兩端橢圓形，直徑15～25 um。依照《真菌鑒定手冊(cè)》和病原菌rDNA－ITS序列分析，確定托克托縣辣椒種植區(qū)炭疽病病原菌屬膠孢炭疽菌。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)病原菌菌絲生長的影響

2.2.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響

溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響

溫度對(duì)病原菌菌絲生長具有很大影響，由圖3可知，該病原菌菌在5～40℃下均可生長，且具有明顯的規(guī)律性，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌落直徑表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的趨勢，但各溫度下的長勢差異較大。在25～30℃菌絲生長較快，且30℃下長勢最好，其次是在25℃，預(yù)測該病原菌的最適生長溫度為25～30℃。35℃下菌絲生長受到明顯抑制，說明該病原菌對(duì)高溫相對(duì)敏感。溫度低于5℃或高于40℃菌絲生長極其緩慢，甚至停止。

2.2.2 pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響

pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響見圖4。

圖4 pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響

pH值對(duì)該病原菌菌絲生長具有明顯規(guī)律性，由圖4可知，病原菌在pH值4～10時(shí)均可生長，最適pH值在7左右。pH值6～9范圍內(nèi)菌絲生長較好，且菌絲致密、邊緣整齊，可見病原菌適宜在中性偏堿的環(huán)境中生長；pH值小于5和高于9菌絲生長均受到不同程度的抑制，菌絲比較稀疏，邊緣不規(guī)則。

2.2.3 光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響

光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響見圖5。

圖5 光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響

光照對(duì)病原菌菌絲生長有一定影響，由圖5可知，光暗交替下更有利于病原菌的生長，完全光照和完全黑暗的條件下，病原菌雖也能生長，但長勢不如光暗交替處理組。而完全光照和完全黑暗條件下菌絲生長差異不是很明顯，光照組比黑暗組長勢稍好，這與宋婷等人[9]的研究結(jié)果一致。

2.2.4 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長的影響

培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長的影響見圖6，不同培養(yǎng)基下的菌落形態(tài)見表1。

圖6 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長的影響

病原菌在不同的培養(yǎng)基上生長狀況有很大差異（見圖6）。從菌落直徑來看，CZ培養(yǎng)基最適合該菌生長，其次是PDA培養(yǎng)基，二者差異不大。在高氏1號(hào)和玉米淀粉培養(yǎng)基中，菌落直徑不及前二者，而在水瓊脂培養(yǎng)基中，菌絲幾乎不生長。從菌落形態(tài)來看（見表1），PDA培養(yǎng)基下的菌絲交聯(lián)致密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，并出現(xiàn)粉色輪紋，而其他培養(yǎng)基菌絲交聯(lián)疏松，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，長勢不佳。綜合來看，PDA培養(yǎng)基最適合病原菌生長。

表1 不同培養(yǎng)基下的菌落形態(tài)

2.3 拮抗菌及其發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用

拮抗菌對(duì)病原菌菌絲的抑制效果見圖7，拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的抑制效果見圖8，拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的抑菌率見表2。

圖7 拮抗菌對(duì)病原菌菌絲的抑制效果

圖8 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的抑制效果

表2 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲的抑菌率

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗菌對(duì)病原菌具有明顯的拮抗作用（見圖7），在病原菌的4個(gè)點(diǎn)上均產(chǎn)生了清晰的抑菌圈，而且在菌落邊緣和抑菌圈接觸部位的菌絲生長緩慢，受到抑制。對(duì)照組的菌落平鋪于平板中央，并呈圓形擴(kuò)展。說明拮抗菌對(duì)病原菌菌絲的生長具有一定的抑制作用。

由圖8可知，在經(jīng)過濾滅菌的拮抗菌發(fā)酵液制成的平板上，病原菌菌絲生長也受到明顯的抑制作用。對(duì)照組菌絲平鋪于整個(gè)平板，且有粉紅色輪紋，而試驗(yàn)組菌絲雖交聯(lián)致密，但生長僅局限在一定的范圍，且沒有出現(xiàn)粉紅色輪紋。這表明，拮抗菌的抑菌作用并不是與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的，而是拮抗菌能夠分泌某種物質(zhì)，這種物質(zhì)抑制了病原菌的生長。

由表2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，拮抗菌的拮抗作用持續(xù)存在，5 d后抑菌率達(dá)60.33%。

2.4 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)致病果實(shí)的防效試驗(yàn)

拮抗菌發(fā)酵液的防治效果見圖9。

圖9 拮抗菌發(fā)酵液的防治效果

辣椒果實(shí)3個(gè)處理經(jīng)保溫保濕培養(yǎng)7 d后，結(jié)果如圖9所示，A，B處理經(jīng)病原菌感染后，在第3天時(shí)均出現(xiàn)了約5 mm的病斑，對(duì)B處理病斑處噴施一定量的經(jīng)過過濾滅菌的拮抗菌發(fā)酵液，培養(yǎng)7 d后，B處理果實(shí)病斑明顯小于A處理果實(shí)的病斑，而C處理的果實(shí)沒有出現(xiàn)病斑，這說明拮抗菌的發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病病原菌有很明顯的抑制作用，且對(duì)健康果實(shí)無害，這對(duì)拮抗菌的后期田間試驗(yàn)尤為重要。

3 結(jié)語

通過構(gòu)建生防菌來防治辣椒病害的研究越來越多[10-11]，生物防治有高效、低毒、低殘留、對(duì)天敵不構(gòu)成威脅等特點(diǎn)[12]，同時(shí)此方法成本低、兼防兼治、增產(chǎn)增收，是一種最有效防治病害的方法[13]。托克托縣地區(qū)辣椒炭疽病的爆發(fā)與當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)習(xí)慣有很大關(guān)系，由于辣椒可給農(nóng)戶帶來可觀的經(jīng)濟(jì)收入，而農(nóng)民耕地有限，因此連續(xù)在同一塊土地種植辣椒，土地缺乏合理輪作換茬，致使土地傳病害蔓延[14]。同時(shí)，氣候條件也是引起當(dāng)?shù)乩苯诽烤也『υ蛑?，?jù)農(nóng)戶反映，連續(xù)陰雨天加上持續(xù)高溫會(huì)導(dǎo)致炭疽病的發(fā)生。研究表明，呼和浩特市托克托縣辣椒種植區(qū)的炭疽病是由膠孢炭疽菌引起的，該病菌在5～30℃均可生長，在25～30℃下最有利于菌絲生長，這與唐景美等人[15]的研究結(jié)果基本相同，也符合托克托縣地區(qū)7月下旬辣椒炭疽病發(fā)病的氣候特征；病原菌對(duì)pH值不敏感，在pH值4～10時(shí)均可生長，但喜歡弱堿性環(huán)境；光照和黑暗環(huán)境都可以影響致病菌菌絲的生長，但是光暗交替更有利于菌絲生長，這與宋婷等人[9]在花椒炭疽病研究的結(jié)果一致；致病菌對(duì)營養(yǎng)條件要求不高，最適生長培養(yǎng)基為PDA，在水瓊脂培養(yǎng)基上停止生長；分離所得拮抗菌對(duì)病原菌菌絲生長有明顯的抑制作用，這種抑制作用并不是拮抗菌與病原菌互相競爭營養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)果，而是拮抗菌通過分泌抑菌物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的；拮抗菌的發(fā)酵液對(duì)致病辣椒果實(shí)也有很好的防效，拮抗菌本身對(duì)辣椒健康果實(shí)無害，這是利用生防菌來防治托克托縣辣椒種植區(qū)炭疽病病害的前提。

試驗(yàn)研究結(jié)果可為辣椒炭疽病的防治提供參考，但是在拮抗菌的抗菌機(jī)制、生物學(xué)特性、拮抗菌鑒定、田間防效試驗(yàn)等方面有待于進(jìn)一步研究。

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