LTBP4過表達對舌鱗狀細胞癌細胞侵襲能力的影響及機制

顧杰林，李正華，葉翀

(貴港市人民醫(yī)院，廣西貴港537100)

舌鱗狀細胞癌(簡稱舌鱗癌)的發(fā)生位置血管及淋巴管非常豐富，故腫瘤細胞易于轉(zhuǎn)移[1,2]，患者預(yù)后較差。細胞偽足的形成被認為是腫瘤細胞獲得侵襲性的標志之一[3，4]。侵襲性偽足的功能主要為通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族降解細胞外基質(zhì)，進而調(diào)控上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5]。已有文獻證實，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的EMT過程能促進侵襲性偽足的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白1(LTBP1)被認為是TGF-β誘導(dǎo)EMT通路中重要的調(diào)控因子。2017年1～10月，我們觀察了LTBP4過表達對舌鱗癌細胞侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討LTBP4在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料舌鱗癌細胞系TCA8113購自美國ATCC公司，DMEM與FBS購自美國Gibico公司，LTBP4、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指E盒結(jié)合蛋白1(ZEB1)、鋅指蛋白(Slug)一抗購自美國Cell Signal Techology，二抗購自北京中杉金橋有限公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，Gelatin購自美國Thermo Fisher公司；Transwell小室購自美國Corning公司。質(zhì)粒的構(gòu)建由漢恒生物技術(shù)有限公司完成。

1.2CON與LTBP4過表達腺病毒構(gòu)建CON質(zhì)粒為空載穿梭pHBAd-CMV-IRES-GFP質(zhì)粒。LTBP4 CDS序列首先使用PCR合成，模板為293t cDNA，引物序列為Sense: 5′-GTCGACACCGGTATGCCGAGGCCTGGCACCAG-3′，Antisense: 5′-GATAGAAAATAGGTGGTTTTTTAGCTATAGCTA-3′。在合成LTBP4后，首先克隆至pHBAd-CMV-IRES-GFP得到LTBP4-pHBAd-CMV-IRES-GFP穿梭質(zhì)粒，將2 μg穿梭質(zhì)粒、4 μg p-BHG(delta)E1,3 cre腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入接種于6 cm2平皿的293A細胞中，轉(zhuǎn)染方式為Lipofectamine2000，步驟根據(jù)說明書進行。轉(zhuǎn)染10天形成病毒空斑，挑起空斑移入新的平皿中，進行擴增，隨后收集感染病毒細胞，反復(fù)凍融3次，裂解細胞得到第一代細胞；進一步擴增，待形成第四代細胞時行大量擴增(30個10 cm2平皿)；隨后反復(fù)凍融細胞得到病毒，使用氯化銫梯度離心法純化腺病毒，2 000 r/min離心2 h，取2.0 mL 1.40 g/mL與3.0 mL 1.30 g/mL中間乳白色條帶，加入透析袋中，4 ℃過夜，得到LTBP4過表達腺病毒。

1.3細胞培養(yǎng)及分組處理TCA8113細胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2孵箱中，培養(yǎng)基為DMEM+10% FBS。培養(yǎng)24 h，將細胞分為對照組與LTBP4組，分別感染CON與LTBP4過表達腺病毒，感染復(fù)數(shù)(病毒數(shù)∶細胞數(shù))為100 MOI，感染48 h，換液并行后續(xù)試驗。

1.4相關(guān)指標觀察

1.4.1細胞LTBP4蛋白表達采用Western blotting法。RIPA裂解細胞后，加入0.2倍體積的5×loading buffer，煮沸15 min后加入預(yù)制膠中，50 V電泳20 min，待marker分開時將電壓加至120 V，恒壓電泳至溴酚藍跑到膠板底部，濕法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入LTBP4一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，加入二抗(1∶500)，37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL液顯色，計算各電泳條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。結(jié)果顯示，LTBP4組LTBP4 蛋白相對表達量為24.31±5.87，高于對照組的1.00±0.22(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

1.4.2細胞侵襲能力采用Transwell小室法。將兩組細胞重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基中，加入Transwell上室，同時在下室加入500 μL完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)，12 h后上室正面使用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干Transwell小室，并使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，棉簽拭去上室正面細胞，顯微鏡拍攝上室背面遷移細胞，使用Image J軟件計數(shù)遷移細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3細胞基質(zhì)降解能力采用基質(zhì)膠降解實驗。首先將200 μL 50 μg/mL多聚賴氨酸鋪于激光共聚焦小皿，室溫靜置20 min；PBS洗2遍，加入200 μL 0.5%戊二醛，室溫靜置15 min；PBS洗2遍，加入200 μL Gelatin膠，室溫靜置15 min；加入200 μL 5 mg/mL四氫硼酸鈉，PBS洗2遍后即得到Gelatin pig oregon green 488激光共聚焦小皿。兩組細胞血清饑餓處理后，使用TGF-β(2 ng/mL)誘導(dǎo)24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.2% TRIton-X 100破膜，5% FBS室溫封閉30 min，加入5 μg/mL Tritc-鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架，加入DAPI標記細胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察基質(zhì)膠降解情況，Image J軟件計算基質(zhì)膠的降解面積。

1.4.4細胞侵襲性偽足形成情況采用熒光共聚焦顯微鏡觀察。將兩組細胞鋪于激光共聚焦小皿中，待細胞貼壁后，4%多聚甲醛固定，使用0.2% TRIon-X 100破膜，5% FBS封閉，加入兔抗cortactin抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜，加入抗兔的綠色熒光標記二抗(1∶400)，DAPI染核，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細胞，以出現(xiàn)cortactin陽性顆粒作為出現(xiàn)侵襲性偽足的指標，計算侵襲偽足出現(xiàn)的細胞比例。

1.4.5E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達采用Western blotting法。具體方法及結(jié)果計算均參照1.4.1。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug、GAPDH一抗?jié)舛染鶠?∶200。

2　結(jié)果

2.1兩組侵襲能力比較LTBP4組侵襲細胞數(shù)為(139±32)個，對照組為(343±49)個，組間比較P<0.01。

2.2兩組基質(zhì)降解能力比較LTBP4組基質(zhì)膠降解面積為(412.4 ±72.1)μm2，對照組為(1 123±82.3)μm2，組間比較P<0.01。

2.3兩組侵襲性偽足形成情況比較LTBP4組侵襲性偽足出現(xiàn)的細胞比例為(7.23±3.12)%，對照組為(18.24±2.31)%，組間比較P<0.01。

2.4兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達比較見表1。

表1　　　　兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3　討論

LTBP家族是一種EMT糖蛋白，其主要功能為結(jié)合TGF-β，促進TGF-β的正確組裝及運輸[5,6]。LTBP與TGF-β在經(jīng)過特定的蛋白酶或其他因素解離后才能被活化[7,8]。LTBP家族最受關(guān)注的功能為通過與TGF-β結(jié)合調(diào)控TGF-β通路。LTBP包括1、2、3、4 四種蛋白，盡管四種蛋白的結(jié)構(gòu)極為相似，但在腫瘤中的表達截然不同。其中，LTBP4主要在心肌、骨骼肌及平滑肌組織中高表達[9]。研究發(fā)現(xiàn)，LTBP4在人與小鼠乳腺腫瘤組織中低表達[10]，通過調(diào)節(jié)TGF-β表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但LTBP4與EMT通路及腫瘤細胞侵襲性之間的關(guān)系尚不明確。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LTBP4在舌鱗癌組織中低表達，提示LTBP4低表達可能參與舌鱗癌的發(fā)生。本研究中我們首先構(gòu)建了LTBP4過表達腺病毒，并用該病毒感染舌鱗癌細胞TCA8113，Western blotting檢測結(jié)果顯示LTBP4組LTBP4蛋白相對表達量顯著升高，提示LTBP4過表達腺病毒成功感染舌鱗癌細胞。進一步通過Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，LTBP4過表達可抑制舌鱗癌細胞侵襲。既往文獻報道，LTBP家族與EMT通路的關(guān)系密切[11]。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug均為EMT通路的關(guān)鍵因子，共同介導(dǎo)EMT過程。在EMT過程中，上皮表型標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)表型Vimentin表達上調(diào)；ZEB1和Slug作為E-cadherin轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控E-cadherin表達，進而調(diào)控EMT過程[12]。本研究結(jié)果顯示，LTBP4過表達可促進E-cadherin蛋白表達，抑制Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達，提示LTBP4可抑制EMT過程。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，強侵襲性的腫瘤細胞可通過侵襲性偽足降解細胞外基質(zhì)從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移[13]。LTBP4已被證實能夠結(jié)合于細胞外基質(zhì)中的TGF-β，從而調(diào)控TGF-β的功能[14]。本研究采用基質(zhì)膠降解實驗檢測LTBP4過表達對細胞外基質(zhì)降解能力的影響，結(jié)果LTBP4組基質(zhì)膠降解面積顯著降低，初步證實了LTBP4過表達TCA8113細胞的細胞外基質(zhì)降解能力降低。進一步通過免疫熒光檢測侵襲性偽足標記物cortactin表達，結(jié)果顯示對照組中出現(xiàn)圓形粗大的cortactin陽性顆粒，并在細胞腹側(cè)面聚集，即認為是侵襲性偽足[15]；本研究LTBP4過表達組該類細胞顯著減少，提示LTBP4在改變EMT通路的同時，能夠通過影響舌鱗癌細胞侵襲性偽足的形成達到對細胞侵襲的調(diào)控。

綜上所述，LTBP4過表達可抑制舌鱗癌細胞侵襲；調(diào)控EMT信號通路，抑制細胞外基質(zhì)降解與侵襲性偽足的形成可能是其作用機制。

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